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Título: Characterization of a candidate gene for drought tolerance in Coffea: the CcDREB1D gene, in contrasting genotypes of Coffea canephora and related species
Autor : Alves, Gabriel Sérgio Costa
Primeiro orientador: Marraccini, Pierre Roger René
Primeiro coorientador: This, Dominique Depigny
Primeiro membro da banca: This, Dominique Depigny
Segundo membro da banca: Etienne, Hervé
Terceiro membro da banca: Grima-Pettenati, Jacqueline
Quarto membro da banca: Kobayashi, Adilson
Quinto membro da banca: Vieira, Luiz Gonzaga Esteves
Palavras-chave: SNPs
Filogenia
Promotor
Plantas transgênicas
GUS
Phylogeny
Promoter
Transgenic plant
Data da publicação: 4-Nov-2015
Agência(s) de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Referência: ALVES, G. S. C. Characterization of a candidate gene for drought tolerance in Coffea: the CcDREB1D gene, in contrasting genotypes of Coffea canephora and related species. 2015. 268 p. Tese (Doutorado em Biotecnologia Vegetal)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2015.
Resumo: A seca é o principal fator que afeta o desenvolvimento das plantas, a floração, o desenvolvimento e qualidade dos frutos, e a produtividade. Em várias espécies, os genes DREBs desempenham papel fundamental na resposta das plantas aos estresses abióticos. No café, vários genes candidatos para tolerância à seca foram identificados, como o CcDREB1D cuja expressão aumenta durante períodos de seca nas folhas de clones de Coffea canephora tolerantes à seca. Com base nessas informações, uma análise extensiva do gene DREB1D foi iniciada com (i) o estudo da diversidade genética deste gene em C. canephora e C. arabica, (ii) a identificação dos membros das subfamílias DREBs de café e avaliação das relações filogenéticas entre CcDREB1D e os seus homólogos de outras espécies e (iii) a realização de uma caracterização funcional de promotores CcDREB1D por transformação genética em C. arabica. Nossos resultados sugerem evidências de associações entre tolerância à seca e variações genéticas nos promotores DREB1D. As análises indicam, também, que esses promotores têm evoluído por rearranjos dos elementos cis que podem influenciar a expressão do gene DREB1D. A recente publicação do genoma de referência de C. canephora nos permitiu identificar a família gênica DREB nesta espécie, composta de pelo menos 31 membros. Em comparação com outras espécies, nenhuma expansão da família DREB foi observada. Análises filogenéticas com genes homólogos de outras espécies permitiu a classificação dos membros da família CcDREBs nos subgrupos I, II, III e IV, em referência a classificação préestabelecida em Arabidopsis. Além disso, CcDREB1D é o ortólogo de C. canephora mais próximo do subgrupo AtDREB1/CBF, porém nenhuma inferência baseada em homologia foi possível em decorrência a uma duplicação recente que ocasionou a funcionalização do subgrupo DREB1/CBF em Arabidopsis. Estes resultados reforçam a necessidade da caracterização funcional do gene CcDREB1D. Um estudo da variabilidade genética revelou uma importante diversidade nucleotídica nos promotores CcDREB1D. Por exemplo, os promotores dos clones 14 (tolerante) e 22 (sensível à seca) de C. canephora conhecidos por exibirem padrões de expressão diferencial do gene CcDREB1D vis-à-vis a seca. A fim de se realizar uma análise funcional destes promotores, sequências truncadas e inteiras dos promotores CcDREB1D alélicos D14-hp15pro e D14-hp16pro e homólogo D22-hp17pro foram fusionadas ao gene repórter GUS. Plantas transgênicas de C. arabica contendo estas construções foram regeneradas. A regulação espaço-temporal e tecido-celular específica dos promotores CcDREB1D foi analisada pela detecção da atividade enzimática de GUS. Em resposta a diferentes tratamentos mimetizando o estresse hídrico (PEG e baixa humidade relativa), a versão completa do promotor permitiu atividade GUS tecido-específica em folhas, precisamente na epiderme, nos parênquimas e células-guarda. Comparando as diferentes construções, os 700 pares de base mais distais dos promotores CcDREB1D alélicos e homólogo demonstraram-se essenciais para a expressão tecido-específica em folhas. Além disso, diferenças na expressão dos promotores alélicos em resposta aos diferentes tratamentos demonstraram que as variações nucleotídicas nas formas alélicas de CcDREB1D afetaram a regulação espacial e temporal do gene repórter GUS.
Abstract: Drought is the key factor affecting plant development, flowering, productivity, fruits development and their quality. In several plant species, the DREBs genes play a key role in plant responses to abiotic stress. In coffee, several candidate genes for drought tolerance have been identified, like CcDREB1D that showed increased gene expression upon drought stress mainly in leaves of Coffea canephora drought-tolerant clones. Based on these information, an in depth characterization of DREB1D was initiated by (i) studying the genetic diversity present in DREB1D loci in C. canephora and C. arabica, (ii) identifying DREB coffee subfamily members and evaluating phylogenetic relations between CcDREB1D and homologs from other plant species, and (iii) performing a functional characterization of CcDREB1D promoters by homologous genetic transformation of C. arabica. Our findings show several evidences of association between drought tolerance and the genetic variations on DREB1D promoter region. Further analyses indicated that these promoters are evolving by the rearrangement of cis-regulatory elements, and could influence DREB1D expression. The recent release of the C. canephora genome sequence allowed us to identify the DREB gene family in this species composed of at least 31 canonical DREB genes. Compared to other plants, no specific amplification of the DREB gene family was observed. A reconciled phylogenetic tree constructed with homologs from other species allowed us to identify the coffee members of the DREB subgroups I, II, III and IV, in reference to their classification previously established in Arabidopsis. In addition, CcDREB1D is the nearest C. canephora orthologue of AtDREB1/CBF group, but any functional inference could not be done due to a recent duplication that lead to DREB1/CBF group subfunctionalization in Arabidopsis. These results reinforced the necessity of CcDREB1D functional characterization in coffee. The study of genetic variability revealed a major source of nucleic diversity in the promoter region of DREB1D genes from C. canephora, with potential implication in local adaptation to drought tolerance. This is for example the case for the promoters of droughttolerant clone 14 and drought-sensitive clone 22 of C. canephora known to present different CcDREB1D expression profiles regarding drought. In order to perform the functional analysis of these promoters, full length and truncated version of allelic D14-hp15pro and D14-hp16pro, and homolog D22-hp17pro forms of CcDREB1D promoters were fused to the GUS reporter gene. Transgenic plants of C. arabica harboring these constructions were regenerated. The spatiotemporal, tissue, cell and allelic-specific regulation of CcDREB1D promoters was analyzed by detecting GUS enzymatic activity. In response to different (PEG and relative humidity) treatments mimicking drought stress, the full-length CcDREB1D promoter drives leaf-specific GUS activity only in epidermic, parenchyma and guard-cells. By comparing the different constructs, the most upstream 700 bp of allelic and homolog CcDREB1D promoters were shown to be necessary for the leaf-specific expression. In addition, allelic-specific expression observed showed that nucleic variations present between CcDREB1D promoter allelic forms affect the spatiotemporal regulation of the GUS reporter gene.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/10562
Publicador: Universidade Federal de Lavras
Idioma: eng
Aparece nas coleções:PPBV - Biotecnologia Vegetal - Doutorado (Teses)



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