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Título: Transformação genética e análise da expressão gênica de clones de Eucalyptus spp sob déficit hídrico
Autor(es): Martins, Guilherme Silva
Orientador: Paiva, Luciano Vilela
Membro da banca: Carneiro, Andréa Almeida
Membro da banca: Brondani, Claudio
Assunto: Seca
Genes de referência
RT-qPCR
Engenharia genética
Drought
Reference gene
Genetic engineering
Data de Defesa: 7-Ago-2015
Data de publicação: 13-Nov-2015
Agência de Fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Referência: MARTINS, G. S. Transformação genética e análise da expressão gênica de clones de Eucalyptus spp sob déficit hídrico. 2015. 134 p. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia Vegetal)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2015.
Resumo: Visando a compreensão dos mecanismos de defesa de Eucalyptus spp. ao déficit hídrico e obter plantas mais tolerantes a esta condição, este trabalho avaliou, via RT-qPCR, o padrão de expressão dos genes EgrCPK26, EgrDREB2, EgrNCED3, EgrPYR1, EgrMET1 e EgrDDM1 em dois clones contrastantes (VM01 - tolerante e VM05 - Sensível) do híbrido Eucalyptus camaldulensis X Eucalyptus urophylla sob condições de déficit hídrico e irrigação, através da normalização com genes de referência adequados. Além disso, este trabalho teve como objetivo a obtenção de plantas do híbrido Eucalyptus grandis X Eucalyptus urophylla, contendo em seu genoma o gene OsCPK5 e avaliar o efeito da inserção deste na expressão dos genes EgrCPK26, EgrDREB2, EgrNCED3 e EgrPYR1. Primeiramente, foram analisados sete candidatos a genes de referência (SAND, IDH, PP2A-3, PP2A-1, UBQ, TUB e EF-1α) através dos algoritmos geNorm, NormFinder, BestKeeper e Delta-Ct, das amostras provenientes dos dois clones de Eucalyptus camaldulensis X Eucalyptus urophylla sob condições de déficit hídrico e irrigação. De acordo com os dados obtidos, verificou-se uma maior estabilidade dos genes SAND e PP2A-3 na maioria dos conjuntos amostrais testados. Alguns estudos sugerem um número mínimo de três genes de referência para a normalização mais precisa da expressão, selecionando assim o terceiro gene mais estável, o EF-1α. Com os genes de referência selecionados, a análise da expressão dos genes EgrCPK26, EgrDREB2, EgrNCED3, EgrPYR1, EgrMET1 e EgrDDM1 foi feita nas amostras dos clones contrastantes sob as condições citadas através da normalização com os três genes de referência (SAND, PP2A-3 e EF-1α). Paralelamente, foram avaliados os potenciais hídricos das mudas de ambos os clones. O clone VM01 apresentou uma expressão mais acentuada dos genes EgrCPK26, EgrDREB2, EgrNCED3 e EgrPYR1 em condições de déficit hídrico quando comparados com o clone VM05. De acordo com a literatura estes genes estão relacionados com várias sinalizações e respostas da planta ao déficit hídrico, demonstrando uma maior expressão em plantas tolerantes. Esses dados corroboram com os valores de potencial hídrico no qual o VM05 apresentou uma diminuição drástica em condições de estresse, enquanto que o VM01 apresentou uma leve diminuição, confirmando a tolerância do clone VM01 perante o déficit hídrico. Visando a obtenção de genótipos mais tolerantes, foi realizado uma transformação genética, via Agrobacterium tumefaciens, a fim de inserir o gene OsCPK5, relacionado principalmente com o fechamento estomático, em plantas do híbrido de Eucalyptus grandis X Eucalyptus urophylla. De acordo com as análises de PCR a inserção do gene de interesse foi realizada com sucesso obtendo quinze plantas geneticamente modificadas contendo o gene OsCPK5. Com as análises da expressão dos genes EgrCPK26, EgrDREB2, EgrNCED3 e EgrPYR1 verificou-se uma diferença na expressão destes quando comparado com plantas não transformadas, demonstrando o impacto da inserção do gene OsCPK5 na resposta das plantas de E. grandis X E. urophylla ao déficit hídrico.
Abstract: Aiming the comprehension of drought defenses mechanisms of Eucalyptus spp. and to obtain tolerant genotypes, this work evaluated, by RT-qPCR, the expression patterns of six genes EgrCPK26, EgrDREB2, EgrNCED3, EgrPYR1, EgrMET1 and EgrDDM1, in two Eucalyptus camaldulensis X Eucalyptus urophylla clones (VM01- drought tolerant and VM05 – drought susceptible) in drought and irrigation conditions. For the expression normalization, references genes was, firstly, used. Besides, this work aimed the development of an Eucalyptus grandis X Eucalyptus urophylla transgenic line with the gene OsCPK5 and evaluated the effect of its insertion in the expression of four genes related to drought response, EgrCPK26, EgrDREB2, EgrNCED3 e EgrPYR1.Primarily, the stability of seven candidates as reference genes (SAND, IDH, PP2A-3, PP2A-1, UBQ, TUB and EF- 1α) was evaluated through the geNorm, NormFinder, BestKeeper and Delta-Ct algorithms, in the two clones of E. camaldulensis X E. urophylla under drought and watered conditions. According to the data found, it was possible to verify a higher stability value of the genes SAND and PP2A-3 in the great part of the samples sets. In addition some studies suggest the normalization using three references genes, selecting the third gene more stable, EF-1α. In the second experiment, the expression of the genes EgrCPK26, EgrDREB2, EgrNCED3, EgrPYR1, EgrMET1 and EgrDDM1 was evaluated in the two clones (VM01 and VM05) in the same conditions tasted before. The reference genes used in the expression normalization was SAND, PP2A-3 and EF-1α. In meanwhile, the water potential of all the treatments was observed. When under drought conditions, the clone VM01 showed a higher expression of the EgrCPK26, EgrDREB2, EgrNCED3 and EgrPYR1then the clone VM05. Based on previous studies, these genes are related to many signaling and tolerance processes against drought, showing a higher expression in tolerant genotypes. These data are supported by the water potential values, which the VM05 presented a severe reduction in stress conditions, whilst the clone VM01 had a slight decrease. In the third experiment, a genetic transformation was done, through the Agrobacterium tumefaciens infection, aiming the insertion of the OsCPK5 gene in Eucalyptus grandis X Eucalyptus urophylla seedlings. Based on the PCR reactions, it was possible to obtain, successfully, fifteen transgenic lines. After the expression analysis of the EgrCPK26, EgrDREB2, EgrNCED3 and EgrPYR1, it was verified a difference in the transformed plants when compared with the wild type, showing an impact of the gene insertion through genetic transformation on the drought response of E. grandis X E. urophylla seedlings.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/10589
Publicador: Universidade Federal de Lavras
Idioma: por
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