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Título: Monitoring Clavibacter michiganensis SUBSP. michiganensis GFP – marked strain inoculated in tomato seeds
Título Alternativo: Monitoramento de um isolado de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis marcado com GFP inoculado em sementes de tomate
Autor(es): Ribeiro, Daniel Henrique
Lattes: http://lattes.cnpq.br/7424333855560791
Orientador: Souza, Ricardo Magela de
Coorientador: Wolf, Jan Martin Van der
Membro da banca: Moura, Andréa Bittencourt
Membro da banca: Figueira, Antonia dos Reis
Membro da banca: Ferreira, Maria Alves
Membro da banca: Santos, Heloísa Oliveira dos
Assunto: Bacterial canker
Confocal laser scanning microscopy
Epifluorescence stereomicroscopy
Green fluorescent protein
Seedlings
TaqMan assay
qPCR
Cancro bacteriano
Microscopia de escaneamento com laser confocal
Microscopia de epifluorescência
Proteína verde fluorescente
Mudas
Ensaio TaqMan
PCR em tempo real
Data de Defesa: 6-Ago-2015
Data de publicação: 9-Dez-2015
Agência de Fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Referência: RIBEIRO, D. H. Monitoring Clavibacter michiganensis SUBSP. michiganensis GFP – marked strain inoculated in tomato seeds. 2015. 129 p. Tese (Doutorado em Agronomia/Fitopatologia)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2015.
Resumo: Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) is an economicallyimportant seed-borne phytobacteria that causes bacterial canker and bacterial wilt, the most important seed-borne disease of tomato. For studies on colonization of tomato seeds, seed treatments, seed transmission and for evaluation of diagnostic methods with Cmm, there is a need for seed that is internally infected with Cmm, how it is observed in natural infections . In this study, a procedure was developed to generate tomato seed (internally-) infected with Cmm. These seeds can be used to evaluate methods for detection of Cmm in seed extracts, to study the effect of seed treatments and to study transmission from seed to seedlings. Seeds were subsequently wounded by scarification, softened by incubation on wetted blotting paper, and inoculated with a spontaneous rifampicin resistant Cmm strain suspension by vacuum-infiltration. A GFP-tagged Cmm strain was used to visualize Cmm in planta. The population dynamics of Cmm on or in (disinfected) seeds and seedlings were studied by plating, a non-invasive monitoring system for GFP-tagged bacteria in plants (PathoScreen), Confocal laser scanning microscopy (CLSM), Epifluorescence stereomicroscopy (ESM) and a TaqMan assay. Also, dead and viable seeds were used to observe the Cmm behavior on and in different seed tissues. To enhance growth of the Cmm in the seeds, they were incubated on wetted blotting paper or on a Cmm-selective medium/broth. Directly after inoculation, a few single Cmm cells could be spotted into the seeds and incubation of seeds resulted in a strong increase of Cmm populations. The increase of the bacteria into the seed was confirmed with the monitoring of the GFP signal by the PathoScreen analyzes. Transected and undivided seeds analyzed with CSLM and ESM indicated that during incubation, Cmm colonized trichome hairs, the outer testa layers, the endosperm and embryo. The GFP signal could also be observed by epifluorescence stereomicroscopy in germinated seeds on the seed coat, cotyledons, stem and roots. Colonization of xylem vessels in stems and roots of seedlings was observed with confocal laser scanning microscopy, indicating systemic infections of germinated seeds. Previous incubation of infected seeds in semi-selective media improved the detection of Cmm by a TaqMan assay. This enhancement was obtained with the increasing of low population densities of Cmm in tomato seeds.
Abstract: Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) é a bactéria causadora da murcha e cancro bacteriano do tomateiro, a mais importante doença transmitida por sementes. Para estudos sobre colonização, transmissão e avaliação de métodos de diagnose de Cmm em sementes, existe a necessidade de infecções internas, como qual se é observado em infecções que ocorrem naturalmente. Neste estudo, um procedimento foi desenvolvido para gerar sementes de tomate internamente infectadas com Cmm. Estas sementes podem ser utilizadas em avaliações de métodos para detecção em extratos de sementes, para estudo do efeito do tratamento de sementes e para o estudo na transmissão de sementes para mudas. Para tal, sementes de tomate foram feridas por escarificação, amolecidas pela incubação em blotters umedecidos e inoculadas com a suspensão de um isolado de Cmm naturalmente resistente a Rifampicina por infiltração a vácuo. Um isolado de Cmm marcado com GFP foi utilizado para a visualização de Cmm in planta. A dinâmica populacional (interna e externa) de Cmm em sementes e mudas de tomate foi estudada por plaqueamento, por um sistema de monitoramento não invasivo para bactérias marcadas com GFP em planta (PathoScreen), por Microscopia de escaneamento com laser confocal (CLSM), Microscopia de epifluorescência (ESM) e um ensaio com TaqMan. Sementes mortas e viáveis foram utilizadas para a observação do comportamento de Cmm em diferentes tecidos. Para estimular o crescimento de Cmm nas sementes, estas foram incubadas em blotters umedecidos ou em um meio/solução nutriente semi-seletivo para Cmm. Imediatamente após a inoculação, algumas células de Cmm puderam ser observadas dentro das sementes e a incubação dessas sementes resultou em um grande aumento desta população. Este aumento da densidade populacional dentro da semente foi confirmado com o monitoramento do sinal de GFP por análises de PathoScreen. Sementes inteiras e cortadas transversalmente analisadas com CLSM e ESM indicaram que durante a incubação, Cmm coloniza os tricomas, as camadas exteriores do tegumento, o endosperma e o embrião. O sinal de GFP também pôde ser observado por ESM na capa de sementes germinadas, cotilédones, caule e raiz. Colonização dos vasos do xilema no caule e raiz das mudas foi observada com CLSM, indicando infecção sistêmica de sementes germinadas. A prévia incubação de sementes infectadas em um meio semi-seletivo aperfeiçoou a detecção de Cmm por TaqMan. Este enriquecimento foi obtido pelo aumento da baixa densidade populacional de Cmm nas sementes de tomate.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/10672
Publicador: Universidade Federal de Lavras
Idioma: eng
Aparece nas coleções: DFP - Agronomia/Fitopatologia - Doutorado (Teses)

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