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Título: Identificação do mecanismo celular de absorção de dsRNA em Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) e seleção de cepas de Bacillus thuringiensis tóxicas contra Helicoverpa armigera (Hübner)
Título Alternativo: Identification of the cellular mechanism of dsRNA uptake in Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) and selection of Bacillus thuringiensis strains toxic against Helicoverpa armigera (Hübner)
Autor(es): Pinheiro, Daniele Heloísa
Orientador: Valicente, Fernando Hercos
Coorientador: Siegfried, Blair D.
Membro da banca: Carneiro, Andréa Almeida
Membro da banca: Damasceno, Cynthia Maria Borges
Membro da banca: Grando, Magali Ferrari
Membro da banca: Mendes, Simone Martins
Assunto: Inseto-praga – Controle biológico
Milho – Doenças e pragas
Bactérias entomopatogênicas
RNA interferente (RNAi)
RNA dupla fita (dsRNA)
Endocitose
Insect-pest – Biological control
Corn – Disseases and pests
Entomopathogenic bactéria
RNA interference (RNAi)
Double-stranded RNA (dsRNA)
Endocytosis
Data de Defesa: 16-Set-2016
Data de publicação: 3-Fev-2017
Agência de Fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Referência: PINHEIRO, D. H. Identificação do mecanismo celular de absorção de dsRNA em Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) e seleção de cepas de Bacillus thuringiensis tóxicas contra Helicoverpa armigera (Hübner). 2017. 138 p. Tese (Doutorado em Ciência dos Alimentos)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2016.
Resumo: RNA interferente (RNAi) é um mecanismo de silenciamento gênico desencadeado por moléculas de RNA dupla fita (double-stranded RNA - dsRNA), amplamente utilizado na pesquisa entomológica, especialmente para a análise funcional de genes. Seu potencial para o controle de insetos pragas tem sido demonstrado através de vários estudos, porém para a efetiva aplicação do RNAi no manejo de insetos pragas é necessário que o dsRNA após ser ingerido pelo inseto seja absorvido do lúmen intestinal e o sinal de silenciamento transportado sistemicamente de uma célula para outra. Diabrotica virgifera virgifera LeConte (larva do milho ocidental) é um dos insetos pragas mais importantes do milho no Estados Unidos. Com o objetivo de identificar o mecanismo envolvido na absorção celular de dsRNA em adultos de D. virgifera virgifera, uma abordagem de “RNAi de RNAi” foi utilizada. Para avaliar se a proteína transmembranar SID-1 (SID-1-like ou SIL) participa da absorção de dsRNA em adultos de D. virgifera virgifera, os insetos foram injetados com silA dsRNA, silC dsRNA ou uma mistura de silA e silC dsRNAs. Posteriormente, dsRNA do gene marcador vATPase-A, foi oferecido aos insetos através da alimentação e a mortalidade dos insetos e expressão do gene vATPase-A avaliadas. Além disso, o envolvimento da endocitose dependente da clatrina na absorção de dsRNA foi analizado através do efeito do silenciamento de cinco importantes genes associados com a endocitose (Clath, Vha16, AP50, Arf72A e Rab7) sobre o RNAi do gene marcador laccase2. Nossos resultados demonstraram que a expressão do gene vATPase-A não foi significativamente aumentada pelo silenciamento dos genes silA e silC em comparação com o tratamento controle no qual os insetos foram injetados com GFP dsRNA e depois alimentados com vATPase-A dsRNA. O silenciamento do gene silC também não afetou a mortalidade da D. virgifera virgifera sugerindo que a proteína SILC não participa da absorção de dsRNA neste inseto. A supressão do gene silA afetou significativamente a mortalidade de D. virgifera virgifera em relação ao controle, mas não foram observados efeitos na expressão do gene vATPase-A, indicando que a proteína SILA não tem um papel fundamental na internalização de dsRNA. O silenciamento dos genes Clath, Vha16 e AP50 inibiu a absorção do laccase2 dsRNA e indução do silenciamento gênico, sugerindo que a endocitose desempenha um papel fundamental na absorção de dsRNA em adultos de D. virgifera virgifera. Entretanto, a supressão dos genes Arf72A e Rab7 não afetou o silenciamento do gene laccase2. Ao contrário do RNAi, o qual é considerado uma técnica relativamente recente, bioinseticidas `a base de Bacillus thuringiensis e plantas geneticamente modificadas expressando proteínas desta bactéria já vem sendo empregados como uma eficiente estratégia no controle de insetos pragas ao longo de muitos anos. Contudo, a seleção de insetos resistentes `as toxinas do B. thuringiensis impulsiona a identificação de novas cepas e genes a serem utilizados com esta finalidade. Afim de selecionar cepas de B. thuringiensis com atividade inseticida contra Helicoverpa armigera (Hübner), bioensaios de toxicidade foram realizados. Oito cepas, 426, 520B, 1636, 1641, 1644, 1648, 1657 e 1658, causaram mortalidade superior `a 75% em H. armigera e apresentaram valores de CL50 entre 150,1 e 1543,3 ng/cm2. Através de análises moleculares foi demonstrado que estas cepas contém diferentes genes cry e vip além de apresentarem um perfil proteico com bandas principais correspondentes `a 140 e 55 KDa. A atividade inseticida das cepas 426, 520B, 1636, 1641, 1644, 1648, 1657 e 1658 também foi avaliada através de bioensaios com Anticarsia gemmatalis (Hübner), Diatraea saccharalis (Fabricius), Spodoptera cosmioide (Walker) e Pseudoplusia includes (Walker), demonstrando que algumas destas cepas também causaram altos níveis de mortalidade nestes insetos. Os resultados obtidos indicam que as cepas de B. thuringiensis selecionadas apresentam grande potencial para serem utilizadas no controle da H. armigera e de outros importantes lepidópteros-praga.
Abstract: RNA interference (RNAi) is a gene silencing mechanism triggered by double-stranded RNA (dsRNA) molecules, widely used in the entomological research, especially for the functional analysis of genes. Its potential for insect pest control has been demonstrated through several studies but for the effective application of the RNAi in the insect management is necessary the uptake of dsRNA from the intestinal lumen after it to be ingested by the insect and the RNAi signal needs to be systemically spread from one cell to another. Diabrotica virgifera virgifera LeConte (western corn rootworm) is one of the most important insect pest of maize in United States. In order to identify the mechanism involved in the cellular uptake of dsRNA in D. virgifera virgifera adults an “RNAi on RNAi” approach was used. To assess whether the transmembrane SID-1 protein (SID-1-like or SIL) participates of the dsRNA uptake in D. virgifera virgifera adults, the insects were injected with silA dsRNA, silC dsRNA or a mixture of silA dsRNA and silC dsRNA. Posteriorly, dsRNA of the marker gene vATPase-A was offered to the insects through feeding, and then the insect mortality and vATPase-A gene expression were evaluated. In addition, the participation of the clathrin-dependent endocytosis in dsRNA uptake was analyzed through the silencing effect of five important genes associated with the endocytosis (Clath, Vha16, AP50, Arf72A and Rab7) on RNAi of the marker gene laccase2. Our results demonstrated that the expression of vATPase-A gene was not significantly increased by silA and silC genes silencing compared to the control treatment, in which the insects were injected with GFP dsRNA and then fed with vATPase-A dsRNA. The silencing of silC gene did not affect the mortality of D. virgifera virgifera adults suggesting that SILC protein does not participate of the dsRNA uptake in this insect. The suppression of the silA gene affected significantly the D. virgifera virgifera adults mortality compared to control, but no effects on vATPase-A gene expression were observed suggesting that the SILA protein does not play a key role in dsRNA uptake. The silencing of Clath, Vha16 and AP50 genes inhibited the internalization of laccase2 dsRNA and induction of gene silencing suggesting that endocytosis plays a critical role in dsRNA uptake in D. virgifera virgifera adults. However, the suppression of the Arf72A and Rab7 genes did not affect the silencing of laccase2 gene. Unlike the RNAi which is considered a relatively recent technique, Bacillus thuringiensis based biopesticides and genetically modified plants expressing genes of this bacteria have been used as an efficient strategy for insect pest control over many years. However, the selection of resistant insects to B. thuringiensis toxins lead to identify new strains and genes to be used with this purpose. Toxicity bioassays were performed to select B. thuringiensis strains with insecticide activity against Helicoverpa armigera (Hübner). Eight strains, 426, 520B, 1636, 1644, 1648, 1657 and 1658, caused mortality higher than 75% in H. armigera larvae and showed LC50 beetwen 150.1 e 1543.3 ng/cm2. Through molecular analysis it was demonstrated that these strains harbor different cry and vip genes. In addition, they showed protein profile with major bands of 140 and 55 kDa. The insecticidal activity of the strains 426, 520B, 1636, 1641, 1644, 1648, 1657 and 1658 was also evaluated through bioassays with Anticarsia gemmatalis (Hübner), Diatraea saccharalis (Fabricius), Spodoptera cosmioide (Walker) and Pseudoplusia includes (Walker), demonstrating that some of these strains cause high levels of mortality in these insects. The results indicate that the selected B. thuringiensis strains have great potential to be used in the control of H. armigera and other important lepidopteran pests.
Informações adicionais: Arquivo retido, a pedido da autora, até novembro de 2017.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/12238
Publicador: Universidade Federal de Lavras
Idioma: por
Aparece nas coleções: PPBV - Biotecnologia Vegetal - Doutorado (Teses)

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