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Título: Relação entre as metilações do DNA e da histona H3 com o comportamento dos sítios de rDNA 45S em cromossomos e núcleos interfásicos de Lolium e Festuca
Título Alternativo: Relationship between DNA methylation and histone H3 methylation with the behavior of the 45S rDNA sites in chromosomes and interphase nucleus of Lolium and Festuca
Autor(es): Ferreira, Marco Túlio Mendes
Lattes: http://lattes.cnpq.br/2754618353847630
Orientador: Techio, Vânia Helena
Coorientador: Mittelmann, Andréa
Membro da banca: Santos, Eliane Kaltchuk dos
Membro da banca: Pereira, Welison Andrade
Assunto: Gramínea – Genótipos
Citogenética
Sítios frágeis
Complexo Lolium-Festuca
Grasses – Genotypes
Cytogenetics
Fragile sites
Lolium-Festuca complex
Data de Defesa: 26-Jan-2017
Data de publicação: 23-Fev-2017
Agência de Fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Referência: FERREIRA, M. T. M. Relação entre as metilações do DNA e da histona H3 com o comportamento dos sítios de rDNA 45S em cromossomos e núcleos interfásicos de Lolium e Festuca. 2017. 64 p. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2017.
Resumo: As gramíneas pertencentes ao complexo Lolium-Festuca apresentam papel de destaque no cenário agropecuário brasileiro, principalmente nas regiões Sul e Sudeste. Elas são mundialmente conhecidas por suprir o déficit forrageiro característico do período de inverno nos países de clima temperado. Por estes e outros motivos, os estudos citogenéticos para as espécies foram impulsionados. Vários são os trabalhos que evidenciaram uma plasticidade do comportamento dos sítios de rDNA 45S, por exemplo, na variação do número e posição dos sítios, relacionados até pouco tempo à possível fragilidade dos loci que, consequentemente, justificava a presença de sítios estendidos e gaps nas metáfases. Essa organização estendida das regiões organizadoras do nucléolo pode ser avaliada em relação a sua atividade/acessibilidade transcricional por meio das alterações epigenéticas. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da metilação nas citosinas (5-mCyt), diretamente relacionada ao silenciamento gênico, e da dimetilação da lisina 9 na histona H3 (H3K9me2), associada a estrutura heterocromática, nas diferentes conformações dos sítios de rDNA 45S, nos núcleos interfásicos e nos cromossomos metafásicos de dois genótipos de cada espécie de Lolium perenne, L. multiflorum e Festuca arundinacea. As técnicas de imunomarcação foram realizadas em combinação com a FISH (hibridização in situ fluorescente) para a localização dos sítios de rDNA. As lâminas foram feitas com células meristemáticas pré-tratadas e não pré-tratadas a -4 ºC, fixadas em Carnoy (etanol:ácido acético, 3:1 v/v) e a imunodetecção, realizada de forma indireta, via anticorpo primário anti-H3K9me2 rabbit policlonal e anti-5-metil-citosina mouse monoclonal. Estes foram detectados com anticorpo secundário anti-rabbit FITC-conjugado e mouse FITC-conjugado. A FISH foi realizada sequencialmente à imunomarcação, utilizando sondas de rDNA 45S obtidas de Triticuma estivum L. (pTa 71). A partir da combinação destas duas técnicas pôde-se perceber uma relação direta entre as marcas epigenéticas e as diferentes conformações das RONs. Nos núcleos interfásicos foram observados predominantemente sítios intra e perinucleolares que, em sua maioria, estavam hipometilados e/ou hiper/hipometilados, descondensados ou parcialmente condensados. Os sítios extranucleolares apresentaram-se predominantemente hipermetilados para ambas as marcas epigenéticas e, consequentemente, eram vistos na forma de blocos condensados heterocromáticos. Nas metáfases foram evidenciados sítios hipermetilados, hipometilados e não metilados. Os sítios de rDNA 45S com gaps identificados nas metáfases estavam sempre hipometilados ou não metilados para H3K9 e também para 5-mCyt, o que justifica o estado descondensado e apto a transcrever. A frequência de sítios com gaps hipermetilados foi muito baixa. Assim, as diferenças estruturais visualizadas nestes sítios nas três espécies estudadas estão relacionadas diretamente com as marcas epigenéticas analisadas, justificando as diferentes conformações nos núcleos interfásicos e ao longo do ciclo celular.
Abstract: The grasses belonging to the Lolium-Festuca complex present a prominent role in the Brazilian agricultural scenary, mainly in the South and Southeast regions. They are known worldwide for supplying the forage deficit characteristic of winter in temperate countries. For these and other reasons, the cytogenetic studies for the species were stimulated. Several studies have demonstrated a plasticity of the 45S rDNA sites behavior, for example, variation in the number and position of the sites related the possible fragility of the loci, that, consequently, justified the presence of extended sites and gaps in the metaphases. This extended organization of the nucleolar organizing regions (NORs) can be evaluated in relation to its transcriptional activity/accessibility through epigenetic changes. Therefore, the objective of this studywas to evaluate the influence of methylation on cytosine (5-mCyt), directly related to gene silencing, and the dimethylation of lysine 9 in histone H3 (H3K9me2), associated with heterochromatic structure, in the different conformations of the rDNA 45S sites, in the interphase nuclei and metaphase chromosomes of two genotypes of each species of Lolium perenne, L. multiflorum and Festuca arundinacea. Immunostaining techniques were performed in combination with FISH (fluorescent in situ hybridization) for the localization of the rDNA sites. The slides were made with pretreated and unpretreated meristemac cells, fixed in Carnoy (ethanol: acetic acid, 3: 1 v / v) and indirect immunodetection with the primary antibodies anti-H3K9me2 rabbit polyclonal and anti-5-methyl cytosine mouse monoclonal. The detection was done using secondary antibodies anti-rabbit FITC-conjugated and anti-mouse FITC-conjugated. FISH Technique was performed sequentially on immunostaining using 45S rDNA probes obtained from Triticuma estivum L. (pTa 71). From the combination of these two techniques it was possible to perceive a direct relation between the epigenetic marks and the different conformations of the NORs. In the interphase nuclei, predominantly intra and perinucleolar sites were observed, which were mostly hypomethylated and/or hyper/hypomethylated, decondensed or partially condensed. The extranuclear sites were predominantly hypermethylated for both epigenetic marks and, consequently, were seen in the form of heterochromatic condensed blocks. Hypermethylated, hypomethylated and non-methylated sites were evidenced in the metaphases. The 45S rDNA sites with gaps identified in the metaphases were always hypomethylated or unmethylated for H3K9 and also for 5-mCyt, which justifies the decondensed and able to the transcription. The frequency of sites with hypermethylated gaps was very low. Thus, the structural differences visualized in these sites in the three species studied are directly related to the analyzed epigenetic marks, justifying the different conformations in the interphase nuclei and throughout the cell cycle.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/12352
Publicador: Universidade Federal de Lavras
Idioma: por
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