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Título: Transmission, colonization and molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli in common bean seeds
Título Alternativo: Transmissão, colonização e detecção molecular de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli em sementes de feijão
Autor(es): Sousa, Marcella Viana de
Orientador: Machado, José da Cruz
Coorientador(es): Munkvold, Gary P.
Membro da banca: Menten, José Otávio Machado
Cardoso, Patrícia Gomes
Figueira, Antônia dos Reis
Alves, Eduardo
Área de concentração: Fitopatologia
Assunto: Fusarium wilt
Green fluorescent protein
Real-time PCR
Seed pathology
Phaseolus vulgaris
Murcha de fusarium
Proteína fluorescente verde
Patologia de semente
PCR em tempo real
Data de Defesa: 27-Nov-2013
Data de publicação: 2014
Agência de Fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Referência: SOUSA, M. V. de. Transmission, colonization and molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli in common bean seeds. 2013. 119 p. p. Tese (Doutorado em Agronomia/Fitopatologia) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2013.
Resumo: O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) é uma cultura de grande importância econômica e social no Brasil por ser uma das dietas básicas da população brasileira. Diversas doenças ocorrem nessa cultura, causando perdas na produção e/ou reduzindo a qualidade das sementes, como é o caso da murcha de fusarium, cujo agente etiológico é Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (Fop). Esse organismo pode ser disseminado por sementes e é classificado como Praga Não Quarentenária Regulamentada no Brasil. Os métodos conhecidos para sua detecção e identificação em sementes são o blotter test e o meio semiseletivo, ambos seguidos pelo teste de patogenicidade. Objetivou-se, neste estudo, ampliar os conhecimentos na transmissão de Fop por sementes de feijão, assim como investigar a interação entre Fop, em sementes infectadas por meio da técnica de GFP, associada à microscopia eletrônica de varredura, além de estabelecer um protocolo para sua detecção em sementes de feijão por PCR, em tempo real (qPCR). No artigo 1, as taxas de transmissão do patógeno foram testadas, a partir de sementes artificialmente e naturalmente associadas ao Fop para plantas emergidas. Dois isolados de Fop, duas cultivares de feijoeiro, duas temperaturas e quatro potenciais de inóculo foram utilizados nos testes a partir de sementes artificialmente inoculadas, com a finalidade de avaliar as plantas sintomáticas e assintomáticas. A frequência de plantas sintomáticas foi menor do que 5%, com taxas de transmissão de 100%. As taxas de transmissão de plantas assintomáticas foram 57% e 49,7%, para BRSMG Majestoso e Ouro Negro, respectivamente. Em relação às temperaturas, as taxas foram 54,4% à 20 ºC e 52,3% à 25 ºC. Para isolados de Fop, as taxas de transmissão foram 83,6% e 94,2% para FOP005 e FOP014. A taxa média no P3 foi 64,4% e, 58% no P1. A partir dos ensaios com sementes naturalmente associadas ao Fop, as taxas de transmissão foram menores do que aquelas determinadas a partir de sementes inoculadas, variando de 8,1% a 16,7%. No artigo 2, Fop foi transformado pela inserção do gene que expressa as proteínas fluorescentes verdes (GFP) e contém o gene de resistência à higromicina-B. A infecção das sementes pelo Fop transformado foi visualizada no embrião das sementes, na plúmula, e no endosperma. Grande quantidade de micélio fluorescente foi observado externamente nas raízes das plântulas de feijão, as quais apresentaram escurecimento vascular, sintoma típico da murcha de fusarium. No artigo 3, os resultados dos experimentos sobre detecção molecular de Fop, em lotes de sementes de feijão, mostraram que primers e sonda específicos, usados como parte do protocolo de qPCR neste estudo, foram viáveis para detectar Fop em sementes infectadas, com alta sensibilidade, a 0,25% de incidência do patógeno em sementes. Os ensaios com TaqMan forneceram resultados mais confiáveis, sensíveis, eficientes e rápidos do que aqueles com SYBR Green, confirmando os relatos anteriores para outros patossistemas. As análises de qPCR, a partir de sementes naturalmente associadas ao Fop, correlacionaram com os resultados obtidos em blotter test, mas estudos adicionais são necessários para otimizar a amostragem e subamostragem, nos testes de sanidade baseados em PCR.
Abstract: The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is a crop of great economic and social importance in Brazil and one of the basic diets of the Brazilian population. Several diseases occur in this crop, causing yield losses and/or decreases in seed quality, such as Fusarium wilt, caused by Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (Fop). This organism can be spread by seeds and it is classified as a Regulated Non-Quarantine Pest in Brazil. The current known methods for its detection and identification in seeds are blotter tests and semi-selective agar medium, followed by a pathogenicity test. The goals in this work were to extend knowledge on seed transmission of Fop in common bean as well as to investigate the close interaction between that fungus in infected seeds through GFP technique associated to scanning electron microscopy and to establish a protocol for detection of this fungus in seeds by real time PCR (qPCR). In paper 1, transmission rates of the pathogen from artificially and naturally Fop-contaminated seeds to emerged plants were tested. Two strains of Fop, two genotypes of bean, two environment temperatures and four inoculum potentials were used in the experiments with artificially inoculated seeds, in order to assess the symptomatic and asymptomatic plants. The frequence of symptomatic plants was lower than 5% but the transmission rates of those plants were 100%. The transmission rates of asymptomatic plants were 57% and 49.7% for BRSMG Majestoso and Ouro Negro, respectively. In respect to comparison between temperatures, the rates were 54.4% at 20 ºC and 52.3% at 25 ºC. For Fop strains, the transmission rates were 83.6% and 94.2% for FOP005 and FOP014. The mean rate at P3 was 64.4% and 58% at P1. From the assays with naturally Fop- contaminated seeds, transmission rates were lower than those determined for inoculated seeds, ranging from 8.1% to 16.7%. In paper 2, Fop was transformed by green fluorescent proteins (GFP) containing the resistance gene of hygromycin-B. Seed infection by the transformed Fop was visualized in the embryo, including the plumule, and in the endosperm. A large amount of fluorescent mycelium was observed externally on bean seedling roots, which presented vascular discoloration, which is the typical symptom of Fusarium wilt disease. In paper 3, the results of the experiments on molecular detection of Fop in common bean seed samples showed that the specific primers and probe used as part of the qPCR protocol in this study were viable to detect Fop in infected seeds with high sensitivity, at 0.25% of Fop incidence. TaqMan assays provided more reliable, sensitive, effective and quicker results than SYBR Green assays, which confirm previous reports for other pathosystems. Analysis of naturally Fop- contaminated seeds by qPCR correlated with results of the blotter test but further studies are needed to optimize sampling and subsampling of seed health testing using PCR-based assays.
Informações adicionais: Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fitopatologia, para a obtenção do título de Doutor.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/1715
Publicador: UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
Idioma: en_US
Aparece nas coleções: DFP - Agronomia/Fitopatologia - Doutorado (Teses)

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