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Título: Inoculação artificial e detecção de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens em sementes de feijão
Título Alternativo: Artificial inoculation and detection of Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens in bean seeds
Autor(es): Deuner, Carolina Cardoso
Orientador: Souza, Ricardo Magela de
Membro da banca: Machado, José da Cruz
Oliveira, José Rogério de
Pinho, Édila Vilela de Resende Von
Figueira, Antonia dos Reis
Área de concentração: Fitopatologia
Assunto: Murcha-de-curtobacterium
Semente
Inoculação
PCR
Restrição hídrica
Seeds
Inoculation
Physiological conditioning
Data de Defesa: 21-Dez-2007
Data de publicação: 31-Jul-2014
Referência: DEUNER, C. C. Inoculação artificial e detecção de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens em sementes de feijão. 2007. 120p. Tese (Doutorado em Agronomia - Fitopatologia) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2007.
Resumo: Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), agente causal da murcha-de-curtobacterium, foi relatado pela primeira vez, no Brasil, em 1995. Apesar de relativamente novo no país, o patógeno está disseminado pelas principais regiões produtoras de feijão, causando grandes prejuízos econômicos. As sementes constituem a sua principal forma de sobrevivência e disseminação. Portanto, o presente trabalho teve como objetivos desenvolver uma técnica eficiente de inoculação, baseada no condicionamento fisiológico do meio, e de detecção, utilizando-se a PCR, de Cff em sementes de feijão, para uso em pesquisas e em laboratórios de análise fitossanitária de sementes. Para o desenvolvimento da técnica de inoculação artificial utilizou-se o condicionamento fisiológico em substrato agarizado. Testaram-se quatro substratos (meio 523, meio 523+KCl, meio 523+manitol e meio 523+sacarose), quatro potenciais hídricos (-0,55, -0,75, -0,95 e -1,15 MPa) e cinco tempos de exposição da semente ao meio 523 (24, 48, 72, 96 e 120 horas). A inoculação artificial consistiu na exposição das sementes de feijão, por 48 horas, ao isolado de Cff, proveniente do estado de Santa Catarina (Cff SC - Feij-2928), no meio 523 com o restritor hídrico manitol no potencial hídrico de -0,95 MPa. Esse tratamento foi o que menos afetou a percentagem de germinação das sementes após o condicionamento fisiológico. Para a otimização da técnica de PCR, foram comparados dois pares de primers descritos na literatura para a detecção dessa bactéria. Um foi desenvolvido a partir de biblioteca cromossomal, construído em plamídeo (CF4-CF5) e o outro a partir do fragmento amplificado via PCR baseado na seqüência repetitiva (Rep-PCR) (CffFOR2-REV4). O par de primers CffFOR2-REV4 demonstrou maior repetibilidade e eficiência na detecção de Cff em sementes de feijão. Foram testados também quatro métodos de preparação do extrato de sementes para a obtenção do DNA de Cff a ser utilizado na PCR: extrato bruto, obtido diretamente das sementes; extrato concentrado em membrana milipore; extrato concentrado por centrifugação e extrato plaqueado em meio seletivo (BioPCR). Dentre esses métodos, tanto a Bio-PCR quanto o extrato concentrado por centrifugação, seja no volume de 20 ou 80 mL, amplificaram segmento de DNA de 306 pb, característico da presença de Cff. Essas duas técnicas apresentam boa sensibilidade, permitindo a detecção de até uma semente contaminada com Cff, em 999 sementes sadias. Portanto, foi possível desenvolver uma técnica rápida, sensível, confiável e de fácil execução para a detecção de Cff em sementes de feijão, constituindo-se em metodologia potencial para uso rotineiro em laboratórios de análise fitossanitária de sementes.
Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), causal agent of common bean bacterial wilt, was first reported in Brazil in 1995. In spite of its relative recent discovery in the country, the pathogen is disseminated throughout most bean producing fields causing high economically important losses. Seed represents the major mean of bacterial survival and dissemination. Thus, the present work aimed to develop an efficient inoculation technique based on a physiological conditioning medium and a Cff PCR-based detection technique for infested bean seeds, to attend research and routine phytossanitary seed analysis demands. For artificial inoculation a physiological conditioning technique in an agar-based medium was used, where four amended media were tested (523 medium, 523 medium+KCl, 523 medium+mannitol and 523 medium+sucrose), four water potentials (-0.55, -0.75, -0.95 and -1.15 MPa) and five exposure times 523 medium (24, 48, 72, 96 and 120 hours). The artificial inoculation consisted of a 48-hour seed exposure to a Cff strain from Santa Catarina state (Cff SC - Feij-2928), in 523 medium amended with mannitol to make a -0.95 MPa water potential. This treatment slightly affected the percent germination after physiological conditioning. To optimize the PCR technique, two primers described in the literature for this bacterium detection, on developed from the chromossomal library build in a plasmid (CF4-CF5) and another one designed from a fragment amplified via conserved repetitive sequence PCR (Rep-PCR) (CffFOR2-REV4). In this study the primer pair CffFOR2-REV4 demonstrated high reprodutibility for Cff detection in bean seeds. Four methods of seed extract preparation were tested to obtain Cff DNA to be used in the PCR: rough extract, obtained directly from seeds; millipore or centrifuge concentrated extract; and media plated extract (BioPCR). Among those methods, either Bio-PCR or centrifuge concentrated extract, in a 20 or 80 mL total volume, all produced a 306 pb DNA fragment, peculiar to Cff. Those two techniques presented good sensitivity allowing the detection of 1 contaminated Cff seed in a total 999 healthy ones. Therefore, a rapid, sensitive and easily performed technique could be developed to detect Cff in bean seeds and will be used routinely in phytossanitary seed analysis.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/1883
Publicador: UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
Idioma: pt_BR
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