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Título: Controle da mancha (Xanthomonas vesicatoria) e pinta (Pseudomonas syringae pv. tomato GFP-marcada) bacteriana do tomateiro por isolados endofíticos de Bacillus sp.
Título Alternativo: Control of bacterial spot (Xanthomonas vesicatoria) and speck (Pseudomonas syringae pv. tomato GFP-marked) in tomato for endophytic strains of Bacillus sp.
Autor(es): Lanna Filho, Roberto
Orientador: Souza, Ricardo Magela de
Membro da banca: Alves, Eduardo
Chalfun Junior, Antonio
Resende, Mário Lúcio Vilela de
Magalhães, Marcelo Murad
Área de concentração: Fitopatologia
Data de Defesa: 1-Ago-2011
Data de publicação: 20-Ago-2014
Referência: LANNA FILHO, R. Controle da mancha (Xanthomonas vesicatoria) e pinta (Pseudomonas syringae pv. tomato GFP-marcada) bacteriana do tomateiro por isolados endofíticos de Bacillus sp.. 2011. 108 p. Tese (Doutorado em Agronomia/Fitopatologia)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2011.
Resumo: Neste trabalho foi reportado o biocontrole exercido pelas bactérias endofíticas Bacillus pumilus e Bacillus amyloliquefaciens, nativas de tomateiro, contra as fitobactérias Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) NS4 GFP-marcada e Xanthomonas vesicatoria (Xv). O isolado NS4 foi obtido por transformação da Pst NW (selvagem) pelo plasmídeo integrativo pNKGFP. Em todos os bioensaios o isolado NS4 apresentou características semelhantes ao NW, sendo escolhido como modelo para estudos contra as bactérias endofíticas. Para os experimentos de biocontrole, plantas de tomate foram pulverizadas previamente com as bactérias endofíticas e, após quatro dias, inoculadas com os isolados NW e NS4. Estes isolados tiveram suas populações reduzidas em filoplano e apresentaram poucas lesões da pinta bacteriana, comparados com oxicloreto de cobre. Em microscopia de epifluorescência (ME), poucas células GFP-alvo do NS4 foram observadas colonizando nichos importantes em filoplano, tendo o contrário sido observado com os antagonistas sob microscopia eletrônica de varredura (MEV). No entanto, folíolos não tratados com os antagonistas apresentaram grande número de agregados de células GFP-alvo. O controle da Xv ocorreu em plantas previamente pulverizadas com as frações proteicas provenientes das bactérias endofíticas, as quais foram cultivadas em meio pobre até atingirem o ponto de inflexão na fase exponencial de crescimento e, em seguida, centrifugadas. O pellet foi descartado e o sobrenadante liofilizado, filtrado (0,22 µm), dialisado (ponto de corte = 12 kDa) e fracionado em coluna contendo Sephacryl S-300 HR equilibrada com tampão fosfato salina (PBS). As frações com maiores concentrações de proteína foram pulverizadas em plantas e, após quatro dias, foi inoculado o patógeno teste. As frações 42 e 75, correspondentes aos picos proteicos de B. pumilus (BPP2) e B. amyloliquefaciens (BAP2), controlaram eficientemente a fitobactéria, em comparação com o controle (água). Adicionalmente, as frações proteicas promoveram em plântula o aumento da atividade das enzimas peroxidase (POX) e polifenoloxidase (PPO), caracterizando o fenômeno de indução de resistência. Em SDS-PAGE corado com nitrato de prata, as frações proteicas 42 e 75 revelaram bandas simples com massa molecular estimada em 43 e 28 kDa, respectivamente. Os estudos demonstraram que as bactérias endofíticas controlaram Pst NS4 expressando o gene GFP em filoplano, bem como sintetizaram duas macromoléculas de natureza proteica que atuaram como eliciadoras das respostas de defesa em tomateiro contra Xv.
In this work we report the biocontrol exercised by the endophytic bacteria Bacillus pumilus and Bacillus amyloliquefaciens, native tomato, against the plant pathogenic bacterium Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) strain NS4 constitutively expressing the GFP gene and Xanthomonas vesicatoria (Xv). The strain NS4 was obtained from the transformation of Pst wild-type strain NW by pNKGFP integrative plasmid. In all of the bioassays the strain NS4 presented characteristics similar to the NW, being chosen as phytobacteria model for studies against the endophytic strains. For the biocontrol experiments, tomato plants were previously sprayed with the endophytic bacteria, and after four days inoculated with the NW and NS4. On the tomato phylloplane the pathogens had their populations reduced, and leaves presented low number of bacterial speck lesions, compared with copper oxychloride. In epifluorescence microscopy (EM), few GFP-tagged cells of the strain NS4 were observed colonizing important niches on phylloplane, the opposite was observed with the antagonists by scanning electron microscopy (SEM). However, leaves not treated with the antagonists presented a large number of GFP-tagged cell aggregates. The control of Xv was performed by induced resistance in plants previously sprayed with the proteic fractions from the endophytic bacteria. The endophytic bacteria were cultivated in nutrient poor medium until they reached the inflection point of the exponential growth phase and soon afterwards were precipitated by centrifugalization. The precipitate was discarded and the supernatant lyophilized, filtered (0.22 µm), dialyzed (cut-off = 12 kDa) and fractionated in a column containing Sephacryl S-300 HR equilibrated with PBS. Fractions that presented the highest protein concentrations were sprayed on tomato plants, and after four days, the test pathogen was inoculated. The protein peaks BPP2 and BAP2 corresponding to the fractions 42 and 75 controlled the phytobacteria efficiently, in comparison with the control (water). Additionally, the protein peaks promoted the increase of the POX and PPO enzyme activity in the plant, characterizing the phenomenon of resistance induction. In SDS-PAGE stained with silver nitrate, the protein fractions 42 and 75 showed as simple bands with estimated molecular mass at 43 and 28 kDa, respectively. Our results clearly demonstrated that the endophytic bacteria can control on phylloplane tomato the plant pathogenic bacterium Pst strain NS4 GFP-marked, and synthesize two macromolecules of proteic nature that act as elicitors of resistance induction in tomato against the Xv.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/3035
Publicador: UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
Idioma: pt_BR
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