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metadata.teses.dc.title: Sistema CRISPR/Cas9 visando a edição genômica no alotetraploide Coffea arabica
metadata.teses.dc.title.alternative: CRISPR/Cas9 system as tool for genome editing in the allotetraploid Coffea arabica
metadata.teses.dc.creator: Freitas, Natália Chagas
metadata.teses.dc.creator.Lattes: http://lattes.cnpq.br/6978283129503612
metadata.teses.dc.contributor.advisor1: Paiva, Luciano Vilela
metadata.teses.dc.contributor.referee1: Benedito, Vagner Augusto
metadata.teses.dc.contributor.referee2: Silva, Anderson Tadeu
metadata.teses.dc.contributor.referee3: Botelho, Flávia Barbosa Silva
metadata.teses.dc.contributor.referee4: Souza, Rafaeli Aparecida Vieira de
metadata.teses.dc.subject: Engenharia genética
Silenciamento gênico
Café - Melhoramento genético
Genetic engineering
Gene silencing
Coffee - Genetic improvement
metadata.teses.dc.date.issued: 2-Apr-2019
metadata.teses.dc.description.sponsorship: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
metadata.teses.dc.identifier.citation: FREITAS, N. C. Sistema CRISPR/Cas9 visando a edição genômica no alotetraploide Coffea arabica. 2019. 91 p. Tese (Doutorado em Biotecnologia Vegetal)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2019.
metadata.teses.dc.description.resumo: A incorporação de técnicas biotecnológicas vem se tornando cada vez mais importante para o auxílio no melhoramento genético convencional, possibilitando avanços mais rápidos na obtenção dos genótipos superiores. Ganhos significativos no melhoramento genético do cafeeiro podem ser alcançados com a edição genômica em Coffea arabica via tecnologia CRISPR/Cas9. A espécie detém a maior importância econômica do gênero Coffea e apresenta uma maior complexidade à nível genômico, já que é uma planta alotetraploide resultante da hibridação natural de C. canephora e C. eugenioides. O silenciamento do gene PDS (fitoeno dessaturase), envolvido na biossíntese de carotenoides, destaca-se como uma boa alternativa para validação do sistema, pois as plantas mutantes normalmente apresentam fenótipo distintamente visível. Nesse contexto, a proposta inicial do trabalho visou verificar a eficiência de edição genômica em C. arabica via tecnologia CRISPR/Cas9 utilizando como prova de conceito a mutação direcionada no gene PDS. Três vetores binários (pCOFEDIT-PDS3, pCOFEDIT-PDS5 e pCOFEDIT-PDS14) foram utilizados para cotransformação de calos embriogênicos via Agrobacterium tumefaciens. Foram obtidos embriões somáticos transgênicos até o estádio cotiledonar apresentando anormalidades fenotípicas e comprometimento nas etapas de crescimento e enraizamento. Devido ao não desenvolvimento satisfatório de plântulas do material submetido à transformação, três embriões que apresentaram morfogênese anormal das folhas com clorose e integração do T-DNA confirmada, foram submetidos ao sequenciamento das regiões alvo. O sequenciamento em pequena escala dos transformantes não foi capaz de detectar mutações no material analisado. Em paralelo, o presente trabalho também visou obter plantas com baixo teor de cafeína pelo silenciamento múltiplo dos genes XMT (xantosina metiltransferase), MXMT (teobromina sintase) e DXMT (cafeína sintase), os quais codificam enzimas relacionadas à síntese da cafeína. Foi verificado a presença de transcritos da Cas9 em plantas submetidas à cotransformação com os vetores binários pCOFEDIT-XMT1, pCOFEDIT-XMT2 e pCOFEDIT-XMT3 via transformação genética estável. Essas plantas apresentaram teores normais de cafeína (1,1 a 1,4%) e juntamente com os dados de sequenciamento comprovaram a ausência de mutação em todos os alelos dos genes alvo. As plantas obtidas neste estudo servirão de base para a compreensão do fator limitante na funcionalidade do sistema CRISPR/Cas9 em C. arabica, permitindo definir quais aspectos serão necessários otimizar para a condução de futuros trabalhos.
metadata.teses.dc.description.abstract: The incorporation of biotechnological techniques has become increasingly important for the conventional plant genetic breeding because after the association between these approaches faster advances have been achieved in obtaining superior genotypes. By using the CRISPR/Cas9 genome editing technology in Coffea arabica the gains in coffee genetic breeding programs could be still more significant. This species is the most important in economic terms within Coffea genus but has also the greater complexity at the genomic level, once C. arabica is an allotetraploid plant resulting from natural hybridization of C. canephora with C. eugenioides. The silencing of the phytoene desaturase (PDS) gene, which has involvement into carotenoid biosynthesis, stands out as a good alternative for CRISPR/Cas9 system validation since the mutant plants regenerated after the transformation procedure will likely present a visible phenotype well different compared to the normal plants. According to the context, the initial purpose of this work focused on verifying the efficiency of genome editing in C. arabica through CRISPR/Cas9 technology by using the sitedirected mutation strategy for the PDS gene as a proof-of-concept. Three binary vectors (pCOFEDIT-PDS3, pCOFEDIT-PDS5 e pCOFEDIT-PDS14) were used to the co-transformation of embryogenic calli with Agrobacterium tumefaciens. Transgenic somatic embryos were obtained until cotyledonay stage. However, these embryos exhibited phenotypic abnormalities and difficulty of growth and development. Based on the unsatisfactory development of the putatively transformed plantlets, three embryos that exhibited abnormal leaf morphogenesis, leaf chlorosis and T-DNA integration had their target regions sequenced. The small-scale sequencing performed for the transformed events was not capable to detect any mutations. In parallel, this work also aimed to obtain plants with low content of caffeine through multiple silencing of the genes xanthosine metyltransferase (XMT), theobromine synthase (MXMT) and caffeine synthase (DXMT), all of which encode enzymes involved in the caffeine synthesis. It was verified the presence of Cas9 transcripts in plants transformed with the binary vectors pCOFEDIT-XMT1, pCOFEDIT-XMT2 e pCOFEDIT-XMT3, showing a stable genetic transformation. These plants presented normal content of caffeine (1.1 to 1.4%) and associated with the sequencing data was possible to confirm the absence of mutation in all the alleles of target genes. The pla nts obtained in this study will be useful to help us better understand on limiting factors that impact on the CRISPR/Cas9 system functionality in C. arabica, allowing us to define which aspects must be optimized to conduct future works.
metadata.teses.dc.description: Arquivo retido, a pedido da autora, até março 2020.
metadata.teses.dc.identifier.uri: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/33439
metadata.teses.dc.publisher: Universidade Federal de Lavras
metadata.teses.dc.language: por
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