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Título: A função das anastomoses entre conídios na recombinação genética em Colletotrichum lindemuthianum
Título Alternativo: Conidial anastomosis tubes function in the genetic recombination in Colletotrichum lindemuthianum
Autor(es): Ishikawa, Francine Hiromi
Orientador: Souza, Elaine Aparecida de
Membro da banca: Costa, Maria Cristina Mendes
Dias, Eustáquio Souza
Queiroz, Marisa Vieira de
Paccola-Meirelles, Luzia Doretto
Área de concentração: Genética e Melhoramento de Plantas
Assunto: Antracnose
Colletotrichum lindemuthianum
Conidial anastomosis tubes
Recombinação assexual
Confocal
Proteínas fluorescentes
Genética de microorganismos
Anthracnose
Colletotrichum lindemuthianum
Conidial anastomosis tubes
Conidial anastomosis tubes
Confocal
Fluorescent proteins
Genetics of microrganisms
Data de Defesa: 4-Ago-2009
Data de publicação: 5-Set-2014
Referência: ISHIKAWA, F. H. A função das anastomoses entre conídios na recombinação genética em Colletotrichum lindemuthianum. 2009. 97 p. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2009.
Resumo: The causal agent of common bean anthracnose, Colletotrichum lindemuthianum, presents a great genetic and pathogenic variability that has complicated the development of resistant cultivars. Several mechanisms are involved in the genetic recombination of filamentous fungi. The objectives of this work were to optimize a production and regeneration protocol for C. lindemuthianum protoplasts to use in genetic manipulation; to study live-cell imaging of conidial anastomosis tubes (CATs) in C. lindemuthianum; and to obtain nuclear labeled strains with fluorescent proteins to show the genetic recombination in the absence of sexual cycle, using live cell-imaging. First of all, to obtain C. lindemuthianum strains from different races labeled with different fluorescent proteins, green (GFP) and red (tdimerRed) respectively, an optimization study was performed on the conditions favourable for the formation and regeneration of protoplasts in this specie. Osmotic stabilizers, lytic enzymes, incubation time and mycellial age were evaluated in terms of their effects on protoplast yield. The optimal condition for protoplast production included the incubation of young mycelia (48 h) in 0.6 mol l-1 NaCl as osmotic stabilizer, with 30 mg ml-1 lysing enzymes from Trichoderma harzianum for 3 h-incubation. Sucrose concentrations of 1.2 mol l-1 and 1 mol l-1 were the most suitable osmotic stabilizers for the regeneration. Using this methodology transformations were performed with the plasmids pMF357 in which H1histone proteins were labelled with eGFP and had the hygromycin resistance genes, and pGR02 in which H4 histone proteins were labelled with tdimerRed and had phleomycin resistance gene. Later, CAT-related aspects of formation and occurrence were studied using four strains of C. lindemuthianum (races 65, 73 and 81). Different culture media, culture age and incubation time were tested and our results showed conditions against germination were necessary for CAT fusion. We developed a novel and robust protocol for CAT studies in order to perform live-cell imaging of CAT fusion which facilitates studies on biological functions of this cell type in a plant pathogen. Vegetative compatibility experiments were performed and indicated the existence of heterokaryon incompatibility in the mature colony between the races 65b (green) and 73 (red). Incompatibility reaction occurred and cell death was observed after hyphae fusion. However, the heterokaryon formation and nuclear migration could be observed between the vegetatively incompatible strains following CAT fusion. Recombination between these races could be shown using the selective markers for resistance to hygromycin and phleomycin. Furthermore, specific primers were designed for the interest genes. Therefore, this mechanism of CAT fusion is a potential source of genetic recombination and/or emerging of new races could explain the occurrence of horizontal gene transfer within species between incompatible strains or between different species arising virulent new pathogens.
O Colletotrichum lindemuthianum, agente causal da antracnose do feijoeiro, apresenta ampla variabilidade patogênica e genética, o que tem dificultado o desenvolvimento de cultivares resistentes. Vários são os mecanismos responsáveis pela recombinação genética em fungos filamentosos. Este trabalho foi realizado com os objetivos de otimizar o protocolo para a obtenção e a regeneração de protoplastos, visando à manipulação genética; estudar a biologia dos tubos de anastomoses entre conídios (CATs) em C. lindemuthianum para análise in vivo e obter transformantes com núcleo marcado com proteínas fluorescentes, visando comprovar a ocorrência de recombinação genética na ausência do ciclo sexual utilizando imagens de células in vivo. Primeiramente, com o objetivo de transformar as diferentes raças de C. lindemuthianum para a marcação do núcleo com proteínas fluorescentes verde e vermelha (GFP e tdimerRed, respectivamente), foi realizado um trabalho de otimização nas condições de obtenção e regeneração de protoplastos desta espécie. Para a formação de protoplastos, foram testados diferentes tipos e concentrações de estabilizadores osmóticos, tempo de incubação, idade micelial e concentração de enzima de lise. Depois de otimizadas as condições para a obtenção dos protoplastos, foram testados diferentes estabilizadores osmóticos para a regeneração. As melhores condições para a obtenção de protoplastos do isolado de C. lindemuthianum foram obtidas utilizando-se micélio com 48 horas, em estabilizador osmótico NaCl 0,6 M, 30 mg.mL-1 da enzima Lysing Enzymes e tempo de digestão de 3 horas. Sacarose 1,2M e 1M foi o estabilizador mais apropriado para a regeneração. Utilizando esta metodologia foram realizadas as transformações com os plasmídeos pMF357, que possui o gene da histona H1 ligada a GFP e o gene de resistência à higromicina e pGR02, que possui o gene de histona H4 em fusão com tdimerRed (vermelho) e o gene de resistência à fleomicina. Posteriormente, os aspectos relacionados à formação e à ocorrência de CATs foram estudados, utilizando-se quatro isolados de C. lindemuthianum, sendo dois pertencentes à raça 65 e um de cada uma das raças 73 e 81. Foram testados diferentes meios de cultivo, idade da cultura e tempo de incubação, demonstrando a necessidade de condições adversas à germinação para a fusão de CATs. Dessa forma, foi possível desenvolver uma metodologia fácil e prática para o estudo de CATs em in vivo e que facilitará estudos da função biológica dessas células em um fitopatógeno. Experimentos de compatibilidade vegetativa foram realizados, indicando a incompatibilidade do heterocário na colônia madura entre as raças transformadas 65b (verde) e 73 (vermelho). A incompatibilidade foi comprovada por meio da morte celular após a fusão de hifas. No entanto, foi possível visualizar a formação do heterocário e a passagem de núcleo entre esses isolados vegetativamente incompatíveis, por meio da fusão de CATs. A recombinação entre os isolados pode ser comprovada utilizando-se os marcadores para resistência aos antibióticos higromicina e fleomicina, além de primers específicos para os genes de interesse. Portanto, este mecanismo de fusão de CATs é uma fonte potencial de recombinação genética e/ou surgimento de novas raças e pode explicar a ocorrência da transferência horizontal de genes dentro dessa espécie entre isolados incompatíveis ou, mesmo, entre diferentes espécies, levando ao surgimento de patógenos mais virulentos.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/3593
Publicador: UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
Idioma: pt_BR
Aparece nas coleções: DBI - Genética e Melhoramento de Plantas - Doutorado (Teses)

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