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Título: Expressão diferencial de genes nas interações entre sementes de milho e Aspergillus flavus, Fusarium verticillioides e Penicillium spp.
Autor : Caixeta, Franciele
Primeiro orientador: Guimarães, Renato Mendes
Primeiro membro da banca: Carvalho, Maria Laene Moreira de
Chalfun Júnior, Antonio
Machado, José da Cruz
Padilha, Lilian
Área de concentração: Produção Vegetal
Palavras-chave: Biblioteca subtrativa supressiva
Genes diferencialmente expressos
Semente de milho
Zea mays
Fungos fitopatogênicos
Suppressive subtractive library
Differentially expressed genes
Seed corn
qRT-PCR
Data da publicação: 2013
Agência(s) de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES
Referência: CAIXETA, F. Expressão diferencial de genes nas interações entre sementes de milho e Aspergillus flavus, Fusarium verticillioides e Penicillium spp. 2012. 104 p. Tese (Doutorado em Produção Vegetal)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2012.
Resumo: As sementes são importante meio para a sobrevivência e para a veiculação de patógenos, que produzem toxinas prejudiciais à saúde humana e animal. Dessa forma, torna-se importante o desenvolvimento de metodologias de detecção rápidas e seguras de patógenos em sementes. O objetivo deste trabalho foi detectar genes diferencialmente expressos associados à presença de A. flavus, F. verticillioides e Penicillium spp. em lotes de sementes de milho, aplicando-se a metodologia de biblioteca subtrativa e análise de expressão por qRT-PCR. Utilizaram-se sementes de híbrido simples de milho, safra 2009/2010. Primeiramente, foi feito um estudo para se determinar o melhor tempo de inoculação dos fungos nas sementes. Para esse estudo, as colônias fúngicas foram isoladas de sementes de vários lotes de milho no teste de sanidade. Dessas colônias, foi obtido 1mL de suspensão de esporos que foi adicionada na placa com BDA+manitol no potencial hídrico -1 MPa. Após o crescimento das colônias, foram distribuídas sementes em camada única e levemente prensadas sob o meio, permanecendo no substrato por diferentes tempos de exposição (0, 24, 48, 72, 96 e 120h). As sementes foram retiradas do meio, secadas sobre papel de filtro e submetidas aos testes de germinação, 1a contagem de germinação, teste de sanidade e teste de tetrazólio. Pelos resultados, pode-se concluir que a infecção é crescente e a qualidade fisiológica decrescente na faixa de 48 a 96h de inoculação das sementes com os fungos A. flavus e F. verticillioides. Para sementes inoculadas com Penicillium spp. a infecção é crescente à medida que se aumenta o tempo de inoculação, porém a qualidade fisiológica não é alterada pelo patógeno. Com esses resultados, para o segundo ensaio, as sementes foram então inoculadas por 48 e 96 horas e foram realizados os testes fisiológicos: germinação, 1a contagem de germinação, sanidade, Tetrazólio e IVG. De acordo com os resultados obtidos nos testes fisiológicos selecionou os tratamentos: testemunha(T), 96 sem fungo (96), 96 com F. verticillioides (F), 96 com Penicillium spp. (P), 96 com A. flavus (A) para construção das bibliotecas subtrativas. Seis bibliotecas de cDNA foram construídas a partir dos mRNAs; Biblioteca 1- TF; Biblioteca 2- TP; Biblioteca 3- TA; Biblioteca 4- 96F; Biblioteca 5- 96P; Biblioteca 6- 96A.Os genes diferencialmente expressos encontrados em cada biblioteca foram clonados e sequenciados. As sequências foram analisadas em bancos de dados. Primers a partir desses genes encontrados foram sintetizados e fez-se a verificação, através de qRT-PCR. A maioria dos genes diferencialmente expressos encontrados relaciona-se a situações de estresse da semente como o gene Poliubiquitina, gene clone 3516, proteína SPATULA, o gene GPC, proteína hipotética, proteína hipotética do milho e o gene da catalase. Já os genes asparto aminotransferase, zinc finger, antranilato sintase, cisteina proteinase e SOD4, apesar de identificados como genes diferencialmente expressos pela biblioteca subtrativa não apresentaram diferença na expressão entre sementes de milho secas, embebidas e infectadas com os fungos F. verticillioides, A. flavus e Penicillium spp, verificadas por qRT-PCR. A metodologia de biblioteca subtrativa supressiva é eficiente para detecação de genes diferencialmente expressos quando os fungos F. verticillioides, A. flavus e Penicillium spp. estão presentes em sementes de milho. A técnica de qRT-PCR validou todas as bibliotecas construídas (TF, TP, TA, 96P e 96A), com exceção da biblioteca 96F.
The seeds are an important means for the survival and propagation of pathogens that produce toxins harmful to human and animal health. Thus, it becomes important to develop methodologies for rapid and reliable detection of pathogens in seeds. The aim of this study was to detect differentially expressed genes associated with the presence of F. verticillioides, A. flavus and Penicillium spp. Batch corn seed, applying the methodology of subtractive library and expression analysis by qRT-PCR. Used a simple hybrid seeds of maize, 2009/2010 harvest.First a study was done to determine the best time of inoculation of fungi on seeds. For this study the fungal colonies were isolated from seeds of various lots of corn sanity check. These colonies was obtained 1 mL spore suspension was added to the plate with PDA + mannitol in water potential -1 MPa. After growth the colonies were distributed in a single layer seeds and lightly pressed under the medium, remaining in the substrate for different exposure times (0, 24, 48, 72, 96 and 120h). The seeds were removed from the medium, dried on filter paper and subjected to germination, first count, sanity and tetrazolium test. From the results, it can be concluded that infection is increasing and decreasing vigor in the range of 48 to 96 hours of seed inoculation with the fungus A. flavus and F. verticillioides. To seed inoculated with Penicillium spp. infection is increasing as it increases the time of inoculation, but the physiological quality is not altered by the pathogen. With these results for the second test, the seeds were then inoculated for 48 and 96 hours and physiological tests were performed: germination, first count, sanity, and Tetrazolium IVG. According to the results obtained in physiological tests selected treatments: control (T), 96 without fungus (96), 96 with F. verticillioides (F), 96 with Penicillium spp. (P), 96 with A. flavus (A) for constructing the subtractive libraries. Six cDNA libraries were constructed from mRNAs; Library 1 - TF; Library 2 - TP; Library 3 - TA; Library 4 - 96F; Library 5 - 96P; Library 6 - 96A.Os differentially expressed genes were found in each library cloned and sequenced. The sequences were analyzed in databases. From these Primers were synthesized genes found and made to verification by qRT-PCR. The majority of differentially expressed genes found are related to stress as the seed polyubiquitin gene, gene clone 3516, SPATULA protein, the gene GPC, hypothetical protein, hypothetical protein from corn and catalase gene. Already asparto aminotransferase genes, zinc finger, anthranilate synthase, cysteine proteinase and SOD4, although identified as differentially expressed genes by subtractive library showed no difference in expression between dry corn seeds, imbibed and infected with the fungus F. verticillioides, A. flavus and Penicillium spp, verified by qRT-PCR. The method of suppressive subtractive library is efficient for detecação of genes differentially expressed when the fungus F. verticillioides, A. flavus and Penicillium spp. are present in maize seeds. The technique of qRT-PCR validated all libraries built (TF, TP, TA, 96P and 96A), with the exception of the library 96F.
metadata.teses.dc.description: Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia/Fitotecnia, área de concentração em Produção Vegetal, para a obtenção do título de Doutor.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/448
Publicador: UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
Idioma: pt_BR
Aparece nas coleções:DAG - Agronomia/Fitotecnia - Doutorado (Teses)



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