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PPBV - Biotecnologia Vegetal - Mestrado (Dissertações) >

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Título: Interação de proteínas Cry1A com as vesículas da borda escovada da membrana (BBMVs) do intestino médio de Spodoptera frugiperda e Diatraea saccharalis e avaliação do tempo de cultivo sobre a produção de β-exotoxina em isolados de Bacillus thuringiensis
Autor(es): Pinheiro, Daniele Heloisa
Orientador: Valicente, Fernando Hercos
Coorientador(es): Paiva, Luciano Vilela
Membro da banca: Pontes, Rose Gomes Monnerat Solon de
Carneiro, Andréa Almeida
Área de concentração: Biologia Molecular
Assunto: Bacillus thuringiensis
Proteína Cry
β-exotoxina
Spodoptera frugiperda
Diatraea saccharalis
BBMVs
Acillus thuringiensis
Cry protein
Data de Defesa: 2013
Data de publicação: 2013
Agência de Fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq
Referência: PINHEIRO, D. H. Interação de proteínas Cry1A com as vesículas da borda escovada da membrana (BBMVs) do intestino médio de Spodoptera frugiperda e Diatraea saccharalis e avaliação do tempo de cultivo sobre a produção de β-exotoxina em isolados de Bacillus thuringiensis. 2013. 125 p. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2013.
Resumo: Bacillus thuringiensis é uma bactéria entomopatogênica capaz de sintetizar diferentes toxinas, tais como δ-endotoxinas com atividade tóxica específica para insetos e β-exotoxina. Esta bactéria é amplamente utilizada no controle biológico de pragas e em várias cultivares geneticamente modificadas através da expressão dos genes das δ-endotoxinas que permitem as plantas tornarem-se tolerantes ao ataque de insetos. Com isto vários eventos de milho transgênicos vêm sendo desenvolvidos, visando o controle de insetos-pragas como Spodoptera frugiperda e Diatraea saccharalis, consideradas importantes pragas desta cultura. Este estudo teve por objetivo analisar a interação das proteínas inseticidas Cry1Aa, Cry1Ab e Cry1Ac com os sítios de ligação do intestino médio de lagartas de S. frugiperda e D. saccharalis e detectar a síntese de β-exotoxina em cepas de B. thuringiensis com potencial de serem utilizadas na formulação de biopestida e avaliar o efeito do tempo de cultivo sobre a produção desta toxina. Para o primeiro trabalho as proteínas Cry1Aa, Cry1Ab e Cry1Ac expressas separadamente em cepas recombinantes de B. thuringiensis foram extraídas, solubilizadas, tripsinadas e marcadas com biotina. As preparações de BBMVs foram extraídas a partir do intestino médio retirado de lagartas do terceiro estádio. Para realizar os estudos de ligação e competição foram realizadas incubações com a toxina biotinilada e preparações de BBMVs na ausência ou presença de um competidor. Os resultados demonstraram que todas proteínas testadas são capazes de se ligar aos receptores do intestino médio das lagartas de S. frugiperda e D. saccharalis. Não foi verificado competição entre as proteínas pelos receptores de ambas pragas, exceto as proteínas Cry1Aa e Cry1Ac que compartilham o mesmo receptor em D. saccharalis. Também foi observado que possivelmente haja sinergismo entre Cry1Ab e Cry1Ac em S. frugiperda. Para o segundo trabalho, o sobrenadante foi coletado de cepas de B. thuringiensis cultivadas durante 48, 72, 96, 120 e 144 horas, autoclavado, filtrado e testado contra lagartas de S. frugiperda através de bioensaios. A análise de 30 cepas de B. thuringiensis demonstrou que 4 cepas (13,3%) apresentaram sobrenadantes tóxicos para S. frugiperda e portando produzem β-exotoxina. Nas cepas que foram positivas para a presença de β- 10 exotoxina incluindo os controles positivos, foi verificado que o tempo de cultivo exerce influência sobre a produção deste metabólito além disso o tempo de cultivo no qual é detectada a síntese da toxina é dependente da cepa visto que foi observado um pico de produção de β-exotoxina a partir de 48, 96 e 144 horas de cultivo, de acordo com os valores da mortalidade e peso médio apresentados pelas lagartas de S. frugiperda nestes tempos de cultivo.
Bacillus thuringiensis is an entomopathogenic bacterium able to produce various toxins such as insects specific δ-endotoxins and β-exotoxin. This bacterium is widely used in biological control of pest and various cultivars genetically modified through expression of δ-endotoxin genes that allow plants to become tolerant to insect attack. Many events of transgenic corn have been developed aiming to control insects such as Spodoptera frugiperda and Diatraea saccharalis, important pests of this crop. This study aimed to analyze the interaction of insecticidal proteins Cry1Aa, Cry1Ab and Cry1Ac with larval midgut binding sites of S. frugiperda and D. saccharalis through binding and competition assays. In addition, it sought to detect the synthesis of β-exotoxin in strains of B. thuringiensis with potential use in formulating biopesticide and assess the effect of culture time on production of this toxin. For the first study proteins Cry1Aa, Cry1Ab and Cry1Ac expressed separately in recombinant strains of B. thuringiensis were extracted, solubilized, trypsinized and labeled with biotin. The BBMVs preparations were obtained from midgut extracted third instar larvaes. Binding and competition studies were performed through incubation biotinylated toxin and BBMVs preparations in the absence or presence of a competitor. The results showed that all proteins tested are able to bind to midgut receptors larvaes of S. frugiperda and D. saccharalis. The heterologous competion assay didn’t show competition between proteins for the binding site in both pests, except Cry1Aa and Cry1Ac proteins that share the same receptor in D. saccharalis. Also was observed possibly there is synergism between Cry1Ab and Cry1Ac in S. frugiperda. For the second study, the supernatant was collected strains of B. thuringiensis grown for 48, 72, 96, 120 and 144 hours, autoclaved, filtered and tested against larvaes of S. frugiperda by bioassays. The analysis of 30 strains of B. thuringiensis showed that supernatants of 4 strains (13,3%) were toxic to S. frugiperda. Also was observed in the strains which were positive for the presence of β-exotoxin including positive controls, that cultivation time influences the production this metabolite in addition the cultivation time at which is detected the synthesis of the toxin is dependent strain wear that was observed a peak production of β-exotoxin from 48, 96 and 144 hours of culture, according with the values of mortality and weight presented by the larvae of S. frugiperda these times of cultivation.
Informações adicionais: Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal, área de concentração em Biologia Molecular, para a obtenção do título de Mestre.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/664
Publicador: UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
Idioma: pt_BR
Aparece nas coleções: PPBV - Biotecnologia Vegetal - Mestrado (Dissertações)

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