Buscar

 

RI UFLA (Universidade Federal de Lavras) >
PPBV - Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Vegetal >
PPBV - Biotecnologia Vegetal - Doutorado (Teses) >

Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/9586

Title: Análises de transcriptoma e RNA de interferência visando entender o mecanismo de resistência da Spodoptera frugiperda à proteína Cry1F
???metadata.dc.creator???: Silva, Rosane Bezerra da
???metadata.dc.contributor.advisor1???: Valicente, Fernando Hercos
???metadata.dc.contributor.referee1???: Gomes, Eliane Aparecida
Noda, Roberto Willians
Carneiro, Andréia Almeida
Damasceno, Cynthia Maria Borges
Keywords: Spodoptera frugiperda
Resistência
RNAi
Silenciamento gênico
Sequenciamento
Genes diferenciamente expressos
Caderina
Spodoptera frugiperda
Resistance
RNAi
Gene silencing
Sequencing
Differentially expressed genes
Cadherin
???metadata.dc.date.submitted???: 16-Mar-2015
Issue Date: 15-May-2015
???metadata.dc.description.sponsorship???: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Citation: SILVA, R. B. da. Análises de transcriptoma e RNA de interferência visando entender o mecanismo de resistência da Spodoptera frugiperda à proteína Cry1F. 2015. 110 p. Tese (Doutorado em Biotecnologia Vegetal)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2015.
???metadata.dc.description.resumo???: Variedades de milho transgênico que expressa a proteína de Bacillus thuringiensis tem sido desenvolvidas para o controle de pragas como S. frugiperda. No entanto, mecanismos de resistência têm sido documentados e pouco se sabe a respeito. RNAi (RNA de interferência) é um processo biológico que causa o silênciamento de moléculas de RNAm-alvo e tem sido utilizado como uma ferramenta poderosa para o estudo das funções dos genes e pode ser utilizado para compreender o mecanismo de resistência e o papel dos genes de Bt na toxicidade ao inseto. Estudos de RNAseq foram realizados para examinar a expressão diferencial de genes em neonatas de S. frugiperda resistentes e susceptíveis a proteína Cry1F. Para obter um transcriptoma abrangente, o RNAm foi sequenciado a partir do intestino médio de larvas do terceiro instar. O sequenciamento com Illumina gerou ~ 903.100.000 milhões de sequencias e depois da montagem com Trinity e remover sequencias duplicadas, um total de 88.378 contigs foram gerados. O tamanho médio dos contigs foi de 1.121 pb variando de 201 a 29.329 pb com N50 em 2.726. Um total de 18.749 contigs tiveram hits no NCBI e 52% dessas sequências tinham maiores similaridades com genes de Bombyx mori. Quase 72% das sequências para as quatro condições experimentais foram mapeados com o transcriptoma de referência e um total de 17.524 contigs foram utilizados para as análises estatísticas no programa R e DESeq, EdgeR e Limma foram analisados separadamente para identificar genes diferencialmente expressos (DEG). DESeq foi mais informativo e um total de 406 genes mostraram diferenças nas expressões para Cry1F entre suscetíveis e resistentes. Quando as larvas susceptíveis foram alimentadas com milho Cry1F, 770 genes foram diferencialmente expressos no DESeq e um baixo número (135) de genes para as larvas resistentes alimentadas com o milho Cry1F. Para avaliar se um gene especifico da caderina está envolvida no mecanismo de resistência à proteína Bt Cry1F. Este foi reduzido em 50% de expressão para larvas neonatas alimentadas com gotículas de dsRNA específico, na concentração de 2 µg/mL e 24 horas de exposição em temperatura ambiente, foi possível detectar uma supressão em 24 horas após as larvas serem transferidas para a dieta artificial. As larvas alimentadas com dsRNA da caderina não apresentaram diferença na mortalidade quando expostas à toxina Cry1F em comparação com os controles. Com um transcriptoma de referência do intestino médio da S. frugiperda foi possível selecionar genes candidatos para o RNAi que mostrou ser uma técnica eficiente para silenciar genes em S. frugiperda, e pode ser usado em estudos futuro podendo apresentar resultado com diferentes genes candidatos envolvidos no mecanismo de resistência em S. frugiperda.
Transgenic maize varieties expressing protein of Bacillus thuringiensis has been developed for the control of pests such as S. frugiperda. However, resistance mechanisms have been documented and little is known about it. RNAi (RNA interference) is a biological process that causes silencing of molecules mRNA-target and has been used as a powerful tool for the study of gene functions and can be used to understand the mechanism of resistance and the role of genes Bt toxicity to insects. RNAseq studies were conducted to examine the differential expression of genes in neonate of S. frugiperda resistant and susceptible to Cry1F protein. To obtain a comprehensive transcriptome the mRNA was sequenced from the midgut of third instar larvae. The sequencing with Illumina generated ~ 903.100.000 million of sequences and after assembly with Trinity and remove duplicate sequences, a total of 88.378 contigs were generated. The average contigs size was 1.121 bp varied from 201 to 29.329 bp with N50 in 2.726. A total of 18.749 contigs had hits in the NCBI and 52% of these sequences were more similarities with Bombyx mori genes. Almost 72% of the sequences for the four experimental conditions were mapped with the reference transcriptome and a total of 17.524 contigs were used for statistical analysis in R and DESeq program, Edger and Limma were analyzed separately to identify differentially expressed genes (DEG). DESeq was more informative and a total of 406 genes showed differences in expressions to Cry1F between susceptible and resistant. When susceptible larvae were fed with corn Cry1F, 770 genes were differentially expressed in DESeq and a low number (135) of the genes to the resistant larvae fed Cry1F with corn. To assess whether a specific cadherin gene is involved in the mechanism of resistance to Bt protein Cry1F. This was reduced by 50% expression of the neonate larvae fed with droplets of specific dsRNA at a concentration of 2 µg / mL and 24 hours exposure at room temperature, it was possible to detect a suppression in 24 hours after the larvae were transferred to artificial diet. Larvae fed with cadherin dsRNA showed no difference in mortality when exposed to Cry1F toxin compared with controls. With the reference transcriptome of the midgut of S. frugiperda was possible to select candidate genes for RNAi which proved to be an efficient technique for silencing genes in S. frugiperda, and can be used in future studies may provide different results with candidate genes involved in mechanism of resistance in S. frugiperda.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/9586
Publisher: UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
???metadata.dc.language???: pt_BR
Appears in Collections:PPBV - Biotecnologia Vegetal - Doutorado (Teses)

Files in This Item:

File Description SizeFormat
TESE_Análises de transcriptoma e RNA de interferência visando entender o mecanismo de resistência da Spodoptera frugiperda à proteína Cry1F.pdf1.49 MBAdobe PDFView/Open

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.


View Statistics

 


DSpace Software Copyright © 2002-2010  Duraspace - Feedback