FABÍOLA CARVALHO SANTOS CITOGENÉTICA E ANATOMIA FOLIAR DE BRACHIARIA RUZIZIENSIS E SUA ASSOCIAÇÃO COM O VALOR NUTRITIVO DA FORRAGEM LAVRAS - MG 2011 FABÍOLA CARVALHO SANTOS CITOGENÉTICA E ANATOMIA FOLIAR DE BRACHIARIA RUZIZIENSIS E SUA ASSOCIAÇÃO COM O VALOR NUTRITIVO DA FORRAGEM Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós- Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas, para a obtenção do título de Mestre. Orientadora Dra. Vânia Helena Techio Coorientador Dr. Fausto de Souza Sobrinho LAVRAS - MG 2011 Santos, Fabíola Carvalho. Citogenética e anatomia foliar de Brachiaria ruziziensis e sua associação com o valor nutritivo da forragem / Fabíola Carvalho Santos. Lavras : UFLA, 2011. 143 p. : il. Dissertação (mestrado) Universidade Federal de Lavras, 2011. Orientador: Vânia Helena Techio. Bibliografia. 1. Melhoramento genético. 2. Plasticidade morfológica. 3. Forrageira. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título. CDD 631.53 Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca da UFLA FABÍOLA CARVALHO SANTOS CITOGENÉTICA E ANATOMIA FOLIAR DE BRACHIARIA RUZIZIENSIS E SUA ASSOCIAÇÃO COM O VALOR NUTRITIVO DA FORRAGEM Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós- Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas, para a obtenção do título de Mestre. APROVADA em 15 de abril de 2011. Dr. Domingos Sávio Campos Paciullo Embrapa Gado de Leite Dr. Fausto de Souza Sobrinho Embrapa Gado de Leite Dra. Lisete Chamma Davide UFLA Dra. Vânia Helena Techio Orientadora LAVRAS - MG 2011 Aos meus pais Dorval e Sonia e aos meus irmãos Ivo e Flávia com a graça de DEUS DEDICO AGRADECIMENTOS A DEUS. Aos meus pais Dorval e Sonia, pelo amor ,afeto e pela pessoa que sou, agradeço todos os dias Aos meus irmãos Ivo e Flavia, que sempre me apoiaram, agradeço pelo carinho. A professora Vânia por cada dia que passa me surpreender com seu carisma de orientadora e sua competência, sempre me guiando para os melhores caminhos, sempre presente e aconselhando, agradeço pela paciência e ensino. A professora Lisete sou eternamente grata pela confiança depositada para que eu seguisse a linha de citogeneticista, pelos ensinamentos, pela grande mãe durante todo esse tempo, carisma e conselhos. A Laboratorista Iara agradeço pela ajuda, companhia durante toda execução do trabalho. A toda equipe de laboratório sou muito grata pela ajuda, carinho, atenção e amizade criada em especial: Aline e Luis Felipe que me ajudaram perante a execução prática do projeto. Ao Dr. Fausto de Souza Sobrinho pela confiança depositada, orientação, disponibilidade dos materiais, sempre eficiente na colaboraçao com o trabalho sou muito grata. Ao Dr. Domingos Paciullo pelo tempo dedicado, sugestões e colaboração na banca. Aos meus amigos do GEN por toda ajuda, amizade, companheirismo, atenção, conselhos sou grata e sentirei saudades. Em especial: Fernando Henrique Toledo, Guedes, Gui, Marcela, Gui, Jeremias, Thiago, Joyce, Bel, Lidi, Isabela e Flávia. Ao professor Evaristo e Ze Airton agradeço pela colaboração no trabalho. Aos funcionários do DBI por nos propiciarem um ambiente limpo e saudável alem da atenção e carinho que recebemos todos os dias. A FAPEMIG agradeço pelo financiamento do projeto. Ao CNPq agradeço a bolsa de estudos. A Embrapa Gado de Leite pelo fornecimento do material agradeço com carinho. Deus concedei-me serenidade para aceitar as coisas que não posso modificar. Coragem para modificar aquelas que posso. E sabedoria para perceber a diferença. RESUMO Recentemente as relações entre anatomia, digestibilidade e qualidade vem sendo amplamente estudadas para dar subsídio aos programas de melhoramento de espécies forrageiras na otimização de tempo e custos na seleção de genótipos, bem como no estudo da plasticidade morfológica. Diante disso, o objetivo do trabalho foi avaliar genótipos de Brachiaria ruziziensis cultivados na época das águas (outubro a março) e da seca (abril a setembro) em relação às características citogenéticas e anatômicas e correlacionar os dados anatômicos com a qualidade e digestibilidade . As análises citogenéticas e anatômicas foram realizadas por meio de técnicas convencionais. A determinação do conteúdo de DNA foi realizada por citometria de fluxo. Existem genótipos promissores para uso no programa de melhoramento, pois a variabilidade anatômica foi evidente entre eles, exceto para as características espessura das epidermes abaxial e adaxial. Também foi constatada a variação entre épocas para as demais características. Verificou-se que existem correlações entre os componentes químicos da parede celular com a digestibilidade. Entretanto, não foram observadas correlações significativas entre as características anatômicas com a digestibilidade. Por meio da determinação do conteúdo de DNA associado com a contagem de cromossomos foi possível discriminar genótipos de B. ruziziensis, B. brizantha e B. decumbens. B. ruziziensis apresentou fórmula cariotípica com 8 cromossomos metacêntricos e 1 submetacêntrico (8m+1sm) e cariótipo simétrico. Palavras-chave: Plasticidade morfológica. Melhoramento genético. Forrageira. Citogenética. ABSTRACT Recently the relationship between anatomy, digestibility and quality has been widely studied to give support to programs for improvement of forage species in optimizing time and costs in the selection of genotypes, and the study of morphological plasticity. Therefore, the aim was to evaluate genotypes of Brachiaria ruziziensis cultivated the dry (April to September) and rainy (October to March) in relation to cytogenetic and anatomical characteristics, and correlating the anatomical characteristics with the quality and digestibility. Cytogenetic analysis and anatomy were evalueted using conventional techniques. The determination of DNA content was analized by flow cytometry. There are promising genotypes for use in the breeding program, because the anatomical variability was evident between them except for the characteristics of thickness abaxial and adaxial epidermis. And found the variation between seasons for other traits. It was found that there are correlations between the chemical components of cell wall and digestibility. However, there were significant correlations between the anatomical traits with digestibility. By determining the DNA content associated with the counting of chromosomes was possible to discriminate genotypes of B. ruziziensis, B. brizantha and B. decumbens. B. ruziziensis presented karyotype with 8 metacentric chromosomes and a submetacentric (8m +1 sm) and symmetrical karyotype. Keywords: Morphological plasticity. Breeding. Forage. Cytogenetics. SUMÁRIO PRIMEIRA PARTE ..............................................................................11 1 INTRODUÇÃO GERAL.......................................................................11 2 REFERENCIAL TEÓRICO.................................................................14 2.1 Importância e aspectos botânico-agronômicos de Brachiaria............14 2.2 Melhoramento genético de Brachiaria .................................................17 2.3 Aspectos anatômicos e relação com a qualidade e digestibilidade da forrageira ................................................................................................20 2.4 Aspectos citogenéticos de espécies de Brachiaria ................................25 REFERÊNCIAS .....................................................................................33 SEGUNDA PARTE ARTIGOS .........................................................43 ARTIGO 1 Características anatômicas adaptativas de genótipos de Brachiaria ruziziensis em diferentes ambientes ...................................43 ARTIGO 2 inter-relações entre anatomia foliar e valor nutritivo de genótipos de Brachiaria ruziziensis na época das águas e da seca......76 ARTIGO 3 Caracterização citogenética e quantificação de dna de Brachiaria ruziziensis ...........................................................................118 11 PRIMEIRA PARTE 1 INTRODUÇÃO GERAL A base para o crescimento da bovinocultura está no uso de forrageiras cuja relação de demanda por variedades novas e adaptadas é proporcional à intensificação da atividade pecuária. No Brasil, a maioria das gramíneas forrageiras de importância econômica é de origem africana, a exemplo de Brachiaria, Panicum e Pennisetum. Entre as nativas, apenas as espécies de Paspalum apresentam valor forrageiro. Essa situação tem requerido dos melhoristas esforços na implantação de programas de melhoramento genético de forrageiras tropicais, para obtenção e/ ou seleção de materiais superiores que possam aumentar a quantidade e qualidade da forragem produzida e a eficiência da produção animal. As espécies de Brachiaria (Trin.) Griseb. apresentam potencial para atingir bons resultados, pois viabilizaram a atividade pecuária nos solos de baixa fertilidade e ácidos do Cerrado e contribuiram para o surgimento de novos pólos de desenvolvimento e colonização no Brasil Central (VALLE et al., 2008). Apesar disso, a quantidade de informações disponíveis sobre este grupo ainda é insuficiente para uso no melhoramento genético. Nos países da América tropical, as fontes de variação para seleção de genótipos superiores provém de apenas cinco acessos de quatro espécies do gênero (B. decumbens Stapf., B. brizantha (Hochst. ex A. Rich.) Stapf. B. humidicola (Rendle) Schweick. e B. dictyoneura (Fig. & De Not.) Stapf.) que geraram as 20 cultivares disponíveis (KELLER-GREIN et al., 1996). Estas espécies apresentam predominantemente poliploidia (2n=4x=36) associada com modo de reprodução apomítico. B. ruziziensis R. Germ. & C. M. Evrard, por sua vez, apresenta reprodução sexual e diploidia (2n=2x=18, genoma R) 12 podendo ser uma alternativa para a realização de cruzamentos e ampliação da variabilidade dentro do gênero. Embora não seja a espécie com maior área cultivada, a demanda por sementes de B. ruziziensis tem aumentado, acompanhando o incremento da integração entre agricultura, pecuária e floresta. Além disso, em relação às demais espécies do gênero, apresenta melhor adaptação a sobressemeadura e menor uso de herbicida na dessecação para estabelecer a cultura seguinte. Outra vantagem é que a produção de sementes é uniforme, pois floresce uma vez ao ano, o que torna o seu controle mais fácil. Entretanto, o pequeno número de cultivares disponíveis no mercado e a carência de informações referentes ao seu potencial forrageiro dificultam a expansão da área cultivada com a espécie (SOUZA SOBRINHO, 2005a), justificando a realização do melhoramento genético. Como parte inerente do programa de melhoramento genético, a avaliação sistemática dos genótipos deve ser feita em diferentes etapas visando identificar os melhores materiais. Neste processo, a citogenética é indispensável para discriminação de genótipos, certificação de ploidias, determinação do número cromossômico e de similaridades cariotípicas e, ainda, para verificação de anormalidades cromossômicas e indicação dos níveis de fertilidade. Estas informações subsidiam as decisões dos melhoristas e contribuem para reduzir o tempo na escolha dos genótipos mais estáveis e compatíveis. Considerando a existência de diferentes níveis de ploidia em Brachiaria, a contagem do número de cromossomos associada à quantificação do DNA via citometria de fluxo constitui uma estratégia de segurança para o melhorista no período que precede a realização dos cruzamentos, especialmente quando se dispõe de uma grande quantidade de genótipos para avaliar e selecionar. Outra contribuição ao programa de melhoramento da Brachiaria pode ser dada por estudos de anatomia foliar. A proporção de tecidos tem sido a 13 característica anatômica usada como indicativo indireto do valor qualitativo, da produtividade e da digestibilidade das forrageiras. A possibilidade de se associar estas características surgiu com a observação de que diferentes tipos de tecidos apresentam taxa e extensão de digestão diferenciadas (AKIN; BURDICK, 1975). Tecidos com elevado conteúdo celular e/ ou delgada parede primária (não lignificada) apresentam alta digestibilidade e tecidos com baixo conteúdo celular e espessa parede celular (freqüentemente lignificada) são normalmente associados à baixa digestibilidade. As medidas da proporção desses tecidos, relacionados com as áreas, podem ser usadas para explicar diferenças qualitativas entre espécies e/ ou cultivares de forrageiras (WILSON, 1997). O objetivo do trabalho é caracterizar genótipos de Brachiaria ruziziensis quanto às características citogenéticas, anatômicas e bromatológicas e verificar a associação entre essas duas útimas. 14 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Importância e aspectos botânico-agronômicos de Brachiaria No Brasil, 90% da carne é produzida em sistemas cuja alimentação do rebanho está baseada exclusivamente em pastagens, com destaque para as gramíneas do gênero Brachiaria e Panicum que apresentam maior valor agregado ao comércio de suas sementes e maior área cultivada (FERNANDES et al., 2000). Aproximadamente 85% das sementes comercializadas anualmente no Brasil Central para implantação, recuperação ou renovação de pastagens utilizam o gênero Brachiaria, visto que estas pastagens cultivadas são mais importantes e, às vezes, a única fonte de alimentação dos bovinos de corte. Essas gramíneas ocupam uma posição de destaque na pecuária nacional, pois se adaptaram bem a solos ácidos e com baixa fertilidade. Além disso, a fácil multiplicação por sementes, associada à agressividade na competição com invasoras, explicam a rápida expansão das braquiárias (VALLE et al., 2008). O gênero Brachiaria pertence à tribo Paniceae e compreende cerca de 100 espécies, distribuídas pelas regiões tropicais e subtropicais, mas com grande concentração no continente africano, em habitats variados, desde várzeas inundáveis até savanas (VALLE et al., 2008). No Brasil, foram introduzidas a partir de 1950 e se expandiram, principalmente nas regiões de clima mais quente, nas décadas de 1970 e 1980 (ZIMMER et al., 1988). Atualmente, encontram-se 15 espécies deste gênero, sendo sete de introdução recente: B. brizantha, B. decumbens, B. dictyoneura, B. humidicola, B. arrecta, B. ruziziensis e B. vittata. (SOARES FILHO, 1996). B. decumbens é perene e se adapta bem ao clima moderadamente úmido, em pastagens abertas ou em áreas com arbustos esporádicos e em solos férteis 15 (BOGDAN, 1977). No Brasil há dois cultivares de Brachiaria decumbens. O primeiro conhecido como cultivar IPEAN, introduzido pelo Instituto de Pesquisa Agropecuária do Norte em Belém PA em 1952, cultivar que apresenta crescimento mais decumbente, com raízes nos nós e folhas muito pilosas. O segundo é proveniente da Austrália, porém de origem Africana e teve seu desenvolvimento inicial no Estado de São Paulo, sendo um cultivar mais robusto, de crescimento sub-erecto e com folhas menos pilosas, sendo conhecido como cultivar Basilisk ou cultivar Australiana (ALCANTARA, 1987). B. brizantha difere de B. decumbens e B. ruziziensis em relação ao porte que é quase ereto, pouco enraizamento nos nós, folhas pilosas em forma de canoa e rácemos geralmente mais longos. B. humidicola apresenta alta capacidade de adaptação a vários tipos de solos, especialmente, os de baixa fertilidade, com alto nível de umidade e ácidos; tolera secas prolongadas e apresenta folhas de cor verde-pálida e fortemente denticuladas nas margens, resistência ao pastejo e à cigarrinha (SOARES FILHO, 1996). B. ruziziensis está mais proximamente relacionada com B. decumbens, da qual difere, no entanto por ser de porte maior e apresentar a gluma inferior distante do resto da espigueta (SOARES FILHO, 1996). É uma espécie perene, sub-ereta, com 1-1,5 m de altura e apresenta a base decumbente e radicante nos nós inferiores. Possui rizomas fortes, em forma de tubérculos arredondados e com até 15 mm de diâmetro. As folhas são lineares e lanceoladas, de cor verde amareladas (SEIFFERT, 1980). A inflorescência é formada por 3-6 racemos de 4-10 cm de comprimento. Ráquis largamente alada, com 4 mm de largura, geralmente de cor arroxeada. Espiguetas de 5 mm de comprimento, pilosas na parte apical, bisseriadas ao longo da ráquis. A gluma inferior tem 3 mm de comprimento e surge 0,5 a 1 mm abaixo do resto da espigueta e o flósculo fértil apresenta 4 mm de comprimento (SENDULSKY, 1977). A propagação de B. ruziziensis se dá por meio de sementes ou vegetativamente. 16 Existem atributos exclusivos e vantajosos de B. ruziziensis em relação às demais espécies de Brachiaria, tais como a diploidia e o modo de reprodução sexual que permitem a realização de cruzamentos e geração de variabilidade para seleção de materiais com características agronômicas superiores. Entretanto, o pequeno número de cultivares disponíveis no mercado e a ausência de informações mais detalhadas referentes ao seu potencial forrageiro dificultam a expansão da área cultivada com essa espécie. Essa situação constitui um fato motivador para a implementação de um programa de melhoramento visando a obtenção de novas cultivares capazes de atender a demanda da pecuária brasileira. No que diz respeito à qualidade da forragem, Souza Sobrinho et al. (2005b) avaliando diferentes cultivares de Brachiaria observaram que a cultivar comum de B. ruziziensis foi a única incluída em agrupamento superior para todas as características em todas as partes da planta avaliadas. Essa cultivar apresentou 63,48%, 52,43% e 57,82% de digestibilidade das folhas, do caule e da planta toda, respectivamente, e maior valor absoluto de proteína bruta (9,47%) e os menores de fibra (FDN e FDA). A superioridade da B. ruziziensis para características bromatológicas de forragem foi constatada também por Hughes et al. (2000). Valle et al. (1988) resumiram estudos de 36 acessos de Brachiaria e observaram que a B. ruziziensis se destacou na qualidade, pois apresentou os menores teores de FDN, FDA, celulose e hemicelulose e cinzas que as demais espécies. A Brachiaria ruziziensis possui alta palatabilidade, alta produtividade de massa, tem potencial produtivo de até 15t MS/ha/ano apresenta boa tolerância ao sombreamento e baixadas úmidas (ARAUCÁRIA SEMENTES , 2010) 17 2.2 Melhoramento genético de Brachiaria A atenção ao melhoramento de forrageiras é uma atividade recente no Brasil e que requer equipes multidisciplinares envolvidas no desenvolvimento de cultivares de melhor qualidade, mais produtivas e adaptadas às condições ambientais encontradas em diferentes regiões do país. Há uma carência de pesquisadores atuando na melhoria de forrageiras tropicais, apresentando uma limitação de conhecimentos básicos e dificultando a obtenção de resultados para o melhoramento genético. Assim como para outras espécies, os programas de melhoramento de forrageiras também utilizam a hibridação como melhor opção para gerar variabilidade e novas cultivares. Poucas são as cultivares obtidas pelo programa de melhoramento, pois a maioria provem de seleções coletadas no país ou introduzidas e outras de trabalhos de seleção em grandes coleções representativas da variabilidade. O CIAT fez coletas na África e montou um banco de germoplasma representativo do gênero Brachiaria. Acessos foram cedidos para Embrapa Gado de Corte uma das responsáveis pelo programa de melhoramento do gênero. A Embrapa Gado de Leite conduz um o programa de melhoramento de Brachiaria ruziziensis e realizou coletas de recursos genéticos explorando a variabilidade natural no Brasil com objetivo de gerar novas variedades por meio de cruzamentos. Os programas de melhoramento de forrageiras possuem objetivos semelhantes aos das grandes culturas, quais sejam, o aumento da produtividade e da qualidade, a resistência a pragas e doenças, a produção de sementes de boa qualidade, o uso eficiente de fertilizantes e a adaptação à estresses edáficos e climáticos (VALLE et al., 2008). Porém, constitui um desafio a um conjunto de problemas diferentes daqueles encontrados para as culturas anuais, devido a existência da complexa relação solo-planta-animal. Assim, o objetivo do 18 melhoramento não se resume em somente obter uma planta mais produtiva, mas em conseguir maior eficiência na produção animal (SOUZA SOBRINHO, 2005c). Entre as forrageiras, o gênero Brachiaria embora de introdução mais recente nas Américas, tem se destacado nos útlimos 30 anos por apresentar boa qualidade forrageira. Alguns autores relatam objetivos específicos deste gênero nos programas como a resistência a cigarrinha, aumento do valor nutritivo, adaptação a solos ácidos, produção de sementes e resistência a Rhizoctonia (MILES; VALLE, 1996; MILLES, 1999; PETERS ;LASCANO, 2003; VALLE, 2001). Dentre as espécies de Brachiaria, somente cinco acessos de B. brizantha, B. decumbens e B. humidicola deram origem aos 20 cultivares liberados em diversos países da América tropical, entre eles: Brasil, Cuba, México, Venezuela, Costa Rica, Colômbia, Panamá e Equador. Poucos acessos ligados somente a três espécies (B. brizantha, B. humidicola e B. decumbens) deram origem as cultivares comerciais, revelando que há uma estreita base genética dos materiais cultivados de Brachiaria. Outro fator considerável pelo estreitamento da base genética é o pequeno número de cultivares hoje disponíveis para a formação de pastagens em relação à extensão territorial e a diversidade edafoclimática do Brasil. Portanto, há necessidade de programas de melhoramento para gerar variabilidade e desenvolver cultivares mais promissoras para essas condições (KELLER-GREIN et al., 1996). A uniformidade genética existente pode ser explicada pelo modo de reprodução desse gênero e pelas barreiras impostas em cruzamentos devido à poliploidia. O mecanismo principal de reprodução é também fator determinante dos métodos de melhoramento mais indicados para cada uma das espécies estudadas (PEREIRA et al., 2001). Todas as cultivares registradas são apomíticas, exceto a única de B. ruziziensis. 19 A apomixia em Brachiaria é apospórica do tipo Panicum e geralmente facultativa, isto é, algumas flores exibem ocasionalmente sacos meióticos passíveis de serem fecundados e originarem híbridos permitindo gerar variabilidade e formar novos genótipos promissores que podem ser selecionados. Portanto, o modo de reprodução apomítico dificulta os cruzamentos, impedindo a variabilidade e aumentando os riscos para os agricultores devido à vulnerabilidade a doenças. Não existem recomendações específicas de métodos de melhoramento para plantas poliplóides e apomíticas como a Brachiaria, mas tanto o CIAT na Colômbia quanto a Embrapa Gado de Corte em Campo Grande-MS, tem utilizado a seleção recorrente em populações geradas por cruzamentos de indivíduos superiores sexuais x apomíticos envolvendo três espécies com destaque nas características agronômicas: B. ruziziensis, como fonte de sexualidade; B. brizantha e B. decumbens, como doadoras de pólen (VALLE et al., 2008). B. brizantha, B. decumbens e B. ruziziensis são empregadas em programas de melhoramento genético, pois devido à proximidade genética possibilitam a formação de híbridos interespecíficos superando as barreiras da ploidia. Cruzamentos entre B brizantha/B decumbens com B. ruziziensis sexual, tetraploidizada artificialmente viabilizaram produção de híbridos para avaliação do desempenho agronômico, ao mesmo tempo foi estudada a herança da apomixia que demonstrou ser simples e dominante sobre a sexualidade (SAVIDAN;VALLE, 1999). Existe ainda a limitação pela diferença de ploidia entre os genitores sexuais (diplóides) e os apomíticos (tetraplóides). Para contornar esse problema pode-se recorrer à haploidização ou à duplicação cromossômica. 20 A identificação de variabilidade genética para as principais características forrageiras dentro de B. ruziziensis possibilita a realização de seleção e obtenção de novas cultivares com ganhos significativos. Além da diploidia e do modo de reprodução sexual, B. ruziziensis é uma espécie perene e promissora para o melhoramento genético, pois apresenta alguns atributos positivos como: elevada qualidade de forragem e valor alimentício, boa produção de sementes, facilidade de estabelecimento, resposta à adubação, alta palatabilidade e aceitação por bovinos. As características desfavoráveis que os programas de melhoramento tentam contornar se resumem a menor adaptação a solos ácidos, úmidos e de baixa fertilidade, susceptibilidade à cigarrinha das pastagens, crescimento reduzido durante os períodos de seca e baixa competição com invasoras. O sucesso de um programa de melhoramento de B. ruziziensis poderá representar impactos altamente favoráveis para a pecuária brasileira. Em um país onde a grande maioria do rebanho é criada a pasto, o desenvolvimento de cultivares de forrageiras com ampla adaptação e pouco exigentes em fertilidade é importante para expansão da área cultivada e consequentemente para o aumento do rebanho bovino. Além disso, a B. ruziziensis é reconhecida dentro do gênero como de qualidade superior da forragem e melhor palatibilidade em relação às demais espécies, ou seja, elevados teores de proteína bruta e digestibilidade e baixo teor de fibras (SOUZA SOBRINHO et al., 2005b). 2.3 Aspectos anatômicos e relação com a qualidade e digestibilidade da forrageira O valor qualitativo das forrageiras é de grande importância no subsídio aos programas de melhoramento que desejam obter um resultado relevante no complexo solo-planta-animal com base na adequada alimentação animal. O 21 valor nutritivo é definido pela sua degradabilidade ruminal, digestibilidade e composição química (POSSENTI;VALARINI, 2003) e pode ser prejudicado pela presença de algumas estruturas e compostos químicos presentes nas forragens. A estrutura anatômica dos órgãos da planta pode influencias na digestibilidade dependendo da constituição de seus tecidos. A proporção de tecidos influencia na acessibilidade e o modo de ação dos microorganimos aos polissacarídeos resultantes da fragmentação das partículas da forrageira, estes tem a capacidade de digerir a celulose e não a lignina. Segundo Brito e Rodella (2001), as características anatômicas da planta podem fornecer uma série de indicações antecipadas sobre o seu potencial de digestibilidade e serem utilizadas como uma primeira aproximação para a caracterização da qualidade das forragens. Estudos multidisciplinares tem sido importantes na determinação do valor nutritivo principalmente quando interligados com a caracterização anatômica. Nas últimas décadas vários autores tem relatado essa associação da anatomia com qualidade de forrageira (ALVES DE BRITO, 1997;1999; PACIULLO 2001; 2002). Diversos pesquisadores também tem avaliado a influência da estrutura anatômica e composição química na digestibilidade (AKIN et al., 1973, AKIN; BURDICK, 1975; CHESSON et al., 1986; HANNA et al., 1973, JUNG;ALLEN 1995; JUNG et al., 1997; QUEIROZ et al.,2000 TWIDWELL et al., 1991;WILSON et al., 1991). Sendo que no Brasil esses estudos são mais recentes (BRITO et al., 1997, LEMPP et al., 1997, 1998, PACIULLO, 2000). Alves de Brito et al. (1999) descreveram os tecidos em ordem decrescente de digestibilidade: parenquimático, floema, epiderme, bainha parenquimática , xilema e esclerênquima e com a utilização da microscopia de varredura concluiu que tecidos lignificados são limitados na digestão. O similar 22 foi observado por Hanna (1973) e Akin (1989), o quais afirmaram que tecidos lignificados são resistentes à digestão. Vários autores também enfatizam a complexidade do estudo da digestão em plantas forrageiras envolvendo vários fatores como idade, posição do perfilho, tipo de tecido, temperatura entre outros. Akin (1989) afirmou que a digestibilidade do parênquima decresce a medida que a forrageira se desenvolve. Segundo Paciullo (2000), a digestibilidade reduz com aumento da idade, enfatizando que o estádio de desenvolvimento é um dos fatores mais relevantes na influência do valor nutritivo. Além disso, existe a influência da estação do ano, em que os valores altos de digestibilidade são encontrados mais nas estações frias do que nas quentes (MACADAM et al., 1996). De acordo com Wilson (1982) em revisão dos efeitos de fatores climáticos sobre o valor nutritivo de espécies forrageiras, a temperatura é o fator mais importante, sendo que a digestibilidade diminui de 0,08 a 1,81 unidades percentuais para cada grau centígrado de elevação da temperatura. Também existem trabalhos contradizendo os anteiores que não apresentaram diferença na estrutura dos tecidos quanto ao clima levando em conta temperatura, fotoperíodo ou estação de ano (AKIN et al.,1987; QUEIROZ, 1997). Outro fator que compromete a digestibilidade é a composição química da parede celular composta principalmente de celulose, hemicelulose, pectina e lignina compreendendo entre 20-80% do peso seco da forragem. Estudos tem encontrado correlações baixas da lignina com a digestibilidade da parede celular (HALIM et al.,1989, JUNG; CASLER, 1991; JUNG;VOGEL,1992) ou até positivas (JUNG et al.,1994). Jung e Allen (1995) relatam que a composição da lignina pode diferir entre espécies, cultivares, frações da planta e tecidos, o que modifica o impacto da lignificação sobre a digestibilidade explicando essas diferenças nas relações. 23 A composição química da parede celular, principalmente a lignina, são fatores JUNG; ALLEN, 1995;). Dependendo da composição da lignina, ou do tipo de lignina core ou non core , pode apresentar altas correlações negativas com a digestibilidade in vitro da matéria seca (DIVMS) (QUEIROZ et al., 2000; JUNG et al., 1997; PACIULLO, 2001), ou até correlações positivas (JUNG et al., 1994). Jung et al. (1997) em gramíneas forrageiras observaram forte correlação negativa entre teores de lignina e DIVMS. A deposição de lignina aumenta com a maturação fisiológica e fatores ambientais como altas temperaturas, diminuindo assim a digestibilidade dos polissacarídeos estruturais pelos ruminantes (JUNG; VOGEL, 1986; KAMSTRA et al., 1958; TERRY; TILLEY, 1964). Tecidos lignificados com parede secundária espessa são pouco digeriveis, apresentando correlação negativa com a digestibilide, como o esclerênquima e o xilema, contribuindo para baixa qualidade da forrageira. Já tecidos como mesofilo e floema apresentam positiva com a digestibilidade devido a facilidade de atuação ou colonização dos microorganimos nestes tecidos no rumem do animal e por não apresentarem parede celular espessa, ou lignificada, sendo portanto digeridos rapidamente. Além disso, existem tecidos com digestão parcial e lenta como as células da epiderme e bainha parenquimática dos feixes, (AKIN et al., 1973; 1989; BRITO et al., 1999). Os constituintes fibrosos (fibra em detergente neutro e fibra em detergente ácido ) também tem sido correlacionados negativamente com a digestibilidade (QUEIROZ et al., 2000; WILSON et al., 1983;). Correlação dos teores de fibra em detergente neutro e fibra em detergente ácido com a digestibilidade, parece estar condicionada ao grau de associação entre os teores de lignina e de fibra. Se esta associação é baixa, o conteúdo de fibra da forrageira não será bom indicador da digestibilidade (VAN SOEST, 1994; QUEIROZ et al., 2000). Os teores de fibra em detergente ácido são, freqüentemente, utilizados para estimativas da 24 digestibilidade. Os coeficientes de correlação entre as concentrações de fibra em detergente ácido e a digestibilidade da matéria seca variam entre -0,5 e -0,95 (MINSON, 1982). O valor nutritivo das gramíneas que se desenvolvem em condições de clima tropical é limitado, não somente pela incidência das elevadas temperaturas, que promovem mais intensa lignificação da parede celular, mas também por características histológicas e anatômicas inerentes à estas gramíneas. Alguns autores acreditam ser relevante a integração de conhecimentos morfológicos e anatômicos da planta com bioquímicos e fatores ambientais (ASHTON; BERLYN 1992; PACIULLO et al.,2002). De acordo com Sylvester et al. (2001) a estrutura anatômica das plantas, em especial, das folhas pode ser influenciada pela luminosidade durante seu crescimento, uma mecanismo denominado de plasticidade morfológica detectada na interação genótipo com ambiente. A interação genótipo x ambiente corresponde à resposta diferencial dos genótipos às mudanças dos ambientes (BOS ; GALIGARI, 1997), evidenciando assim, a dependência entre os efeitos genéticos e ambientais. Visto que o principal objetivo de um programa de melhoramento é selecionar genótipos de consistência e elevada produtividade nos mais diversos ambientes, a análise da interação genótipo com ambiente é de grande importância. Alguns autores discutem a influência da luz e temperatura na anatomia foliar, principalmente no desenvolvimento do órgão. Especificamente em Brachiaria existem estudos da anatomia do colmo e da folha na alternância do período seco e chuvoso, (PACIULLO, 2002). Estudos recentes avaliando a influência da estrutura anatômica sobre a qualidade de gramíneas forrageiras ainda são escassos, tendo em vista o 25 potencial de desenvolvimento desta área. A necessidade de se estabelecer um banco de informações à respeito da anatomia das diferentes gramíneas forrageiras, incluindo a proporção de tecidos, os fatores que determinam a digestão da parede celular e, consequentemente, dos diferentes tecidos, a influência da estrutura anatômica sobre o consumo pelo animal, entre outros, torna-se evidente para permitir avanços no conhecimento das relações entre os fatores anatômicos e a qualidade das gramíneas forrageiras. O estudo anatômico de lâminas foliares de gramíneas forrageiras tem auxiliado na compreensão das diferenças qualitativas entre essas plantas, que algumas vezes não são detectáveis em análises químicas (LEMPP et al., 2002), sendo possível classificar os tipos de fatores de antiqualidade por meio da anatomia e da histoquímica vegetal. Além disso, normalmente essas análises são mais rápidas e de menor custo, quando comparadas às análises das características bromatológicas da forragem. Esse fato permite a avaliação de maior número de materiais em um período mais curto de tempo, com redução de custos, contribuindo para maior agilidade do programa de melhoramento. 2.4 Aspectos citogenéticos de espécies de Brachiaria Os primeiros estudos de citogenética com espécies do gênero Brachiaria reportam-se à metade do século passado. Como resultado, informações básicas importantes relacionadas à determinação do número cromossômico, à construção dos cariótipos, mapeamento fisiso e ao comportamento meiótico foram apresentadas por diferentes autores, constituindo uma base de dados, ainda insuficiente, sobre a estrutura genética e citogenética do gênero. Na década de 80, o conhecimento citogenético do gênero Brachiaria se restringia a apenas 35% das espécies, e abrangia somente contagens cromossômicas (BASAPPA et al., 1987). Alguns estudos envolvendo contagens 26 cromossômicas (BERNINI, 1997) e determinação do nível de ploidia por citometria de fluxo, Ishigaki 2010; Leteriello, 1999; Penteado et al., 2000, foram, posteriormente, desenvolvidos. O número básico de cromossomos relatado para o gênero é x = 7, 8 e 9, com predominância de x=9 (BASAPPA et al., 1987; DARLINGTON; WYLIE, 1955; DUJARDIN 1979; MORRONE; ZULOAGA, 1992; VALLE; SAVIDAN, 1996). Todavia, recentemente Risso-Pascotto et al. (2006) relataram a ocorrência de x = 6 para acessos de B. dictyoneura, os quais apresentaram 2n = 24, e B. humidicola, com 2n=42. Boldrini et al. (2009) observaram na meiose presença de seis univalentes em B. humidicola propondo também o numero básico x=6 cromossomos. O grande número de anormalidades meióticas em espécies de Brachiaria dificulta estudos como estes. A maioria das espécies do gênero Brachiaria é poliploide, preferencialmente tetraploide (2n=4x=36) e apomítica (BASAPPA et al. , 1987; BERNINI; MARIN-MORALES 2001, MENDES BONATO et al., 2002, 2006; PENTEADO et al., 2000; RISSO-PASCOTTO et al., 2006 ; SOTO-MAYOR- RÍOS et al ., 1968; UTSUNOMIYA et al. 2005, VALLE; SAVIDAN, 1996) . Em B. ruziziensis, um estudo feito com 36 acessos por Valle e Savidan (1996) não encontrou saco embrionário apomítico, confirmando ser uma espécie diploide sexual, utilizada como base nas hibridações interespecíficas quando tetraploidizada artificialmente. Em 1987, Basappa e colaboradores publicaram resultados da contagem de cromossomos de espécies de Brachiaria realizada em 260 populações representativas de diferentes regiões geográficas do mundo. Foram descritas seis espécies diploides, vinte tetraploides, cinco hexaploides e três octaploides entre os materiais avaliados. Exceto para B. setigera var. setigera a qual foi caracterizada como um complexo agâmico com uma série heteroplóide, para as demais espécies não foram distinguidas raças cromossômicas. 27 Posteriormente, em um estudo realizado no Brasil, Bernini e Marin- Morales (2001) caracterizaram o cariótipo de 12 acessos e cinco espécies de Brachiaria. Os autores relataram variações no número cromossômico em B. decumbens (2n=18 e 36) e em B. humidicola (2n=36, 42 e 54). B jubata e B. brizantha apresentaram 2n=36 e B. ruziziensis, 2n=18. Nestas análises, com exceção de um acesso de B. humidicola (x=7), os demais apresentaram número básico de cromossomos igual a 9. Os cariótipos foram classificados como simétricos com tendência à assimetria em direção aos poliplóides. Foi sugerido também que alterações estruturais como deleções e adições e, principalmente, poliploidia estão envolvidas na evolução desse gênero. A associação das informações das análises morfológicas, citológicas e moleculares possibilita estabelecer as relações de parentesco e observar muitas características intermediárias entre B. brizantha, B. decumbens e B. ruziziensis (TOHME et al., 1996). Basappa et al. (1987) descreveram que as irregularidades meióticas ocorrentes em B. decumbens, assemelham-se às encontradas em B. ruziziensis (n=9) e B. brizantha var. brizantha (n=27), indicando que a espécie é um híbrido natural desta última. A proximidade entre essas espécies permite a obtenção de híbridos, tais como descrito por Hacker (1988) entre B. ruziziensis tetraploidizada e B. decumbens e B. brizantha, constituindo uma excelente alternativa para ampliação da base genética do gênero e para aplicações no melhoramento genético. Comparações entre as características morfológicas e moleculares da literatura e os dados cariotípicos propostos por Bernini e Marin-Morales (2001) sugerem que a diferenciação cromossômica observada nos acessos de Brachiaria não foi acompanhada por grandes mudanças morfológicas. As espécies B. brizantha, B. decumbens e B. ruziziensis mesmo apresentando caracteres morfológicos similares e capacidade de cruzamento, têm características cariotípicas distintas, o que fornece uma informação adicional 28 para o estabelecimento das relações de parentesco entre as espécies de Brachiaria . No mesmo trabalho foi observado que a diferença no número básico e cariotípica indicou presença de diferentes genomas ou rearranjos dos cromossomos nos acessos das espécies. Stephan Nielen et al. (2010) estudou a morfologia dos cromossomos e foi o primeiro a utilizar a hibridização in situ (FISH) com genes ribossomais 5S e 45S para localização de sítios de DNA ribossomal em acessos diploide sexual e um tetraploide apomítico de Brachiaria brizantha. O autor encontrou resultados de similaridades morfológicas entre os acessos tetraplóides descritos por Bernini e Marin Morales (2001) em relação a possição do centrômero, embora no tamanho dos cromossomos tenham sido maiores. Os resultados morfológicos discutidos e comparados dos dois autores sugerem possíveis alterações estruturais durante a evolução, além de uma distância filogenética entre os acessos analisados por eles. Estudos recentes tentaram elucidar a hipótese do tipo de ploidia no gênero Brachiaria. Mendes-Bonato (2002), relatou ser uma alopoliploidia segmental através da análise do comportamento meiótico com uma freqüência baixa de multivalentes. Já Stephan Nielen et al. (2010) utilizando a técnica do FISH sugeriu a alopoliploidia pelo número de marcas encontradasdo DNAr 5s, em acessos diploide e tetraploide de Brachiaria brizantha, um e três pares respectivamente. Outros autores corroboram com essa hipótese da alopoliploidia (BOLDRINI et al., 2009; MENDES-BONATO et al., 2002, MENDES et al., 2006; RISSO PASCOTTO et al., 2006) Trabalhos realizados por Ito et al (2000) e Akiyama et al, (2008) pesquisando sequências altamente repitivas no genoma utilizando o FISH com 5S e 45S de DNA ribossomal em Brachiaria encontraram marcas localizadas em cromossomos específicos podendo distingui-los Akiyama et al., 2010 encontrou numero de marcas do 25S rDNA correspondendo ao nível de ploidia, alem disso 29 a morfologia dos cromossomos foi diferente dentro e entre espécies. Indicou também presença de diferentes genomas nas espécies. Na descrição do cariótipo feita por Bernini e Marin-Morales (2001), o acesso diplóide R134 de B. ruziziensis (2n=18) apresentou dois pares de cromossomos metacêntricos stricto sensu e os outros sete pares metacêntricos, com presença de satélite no par de cromossomos 8. Stephan Nielen et al. (2010) encontrou o satelite no mesmo par de crromossomos no acesso analisado de um diplóide sexual de Brachiaria brizantha sugerindo então possíveis alterações estruturais durante a evolução desses acessos. Anteriormente, Valle et al. (1987) havia identificado os nove cromossomos por meio de mapas paquitênicos e observando a distribuição e tamanho dos cromômeros e medições cromossômicas. Esses dados mostraram que a maioria dos cromossomos eram submetacêntricos, com a região organizadora do nucléolo (RON) no par 7. Bernini e Marin-Morales (2001) descreveram a existência de similaridades entre esse acesso de B. ruziziensis e o diplóide D5 de B. decumbens (2n=18) para o comprimento do lote haplóide e para a morfologia cromossômica. Especificamente para B. ruziziensis, os relatos na literatura sobre o os cromossomos mitóticos e o comportamento meiótico são restritos. Shank and Sotomayor- Rios estudaram (1968) eventos citológicos da megasporogênese em uma população de B ruziziensis relatando número cromossômico somático igual a 18. Ferguson (1974) confirmou n=9 em 22 plantas de 16 acessos, com meiose regular apresentando 9 bivalentes formados na diacinese. Não foram encontrado relatos de saco embrionário apomítico nessa espécie em ambos trabalhos. A citometria de fluxo vem sendo amplamente utilizada na quantificação de DNA nuclear em plantas, ( BENNETT et al., 2000; SCHIFINO- WITTMANN, 2001), Essa técnica vem sendo utilizada em diversos grupos de gramíneas, tais como , 1997), Pennisetum (MARTEL et al., 1997), Crepis 30 (DIMITROVA; GREILHUBER, 2000) e Brachiaria (PENTEADO et al., 2000; TIMBÓ, 2010) entre muitos outros. Para a grande maioria, a técnica tem tido sucesso por permitir avaliar grande numero de indivíduos, com precisão e rapidez alem de apresentar pouca variação dos resultados obtidos em diferentes laboratórios (LYSÁK; DOLE EL, 1998). Essa técnica pode ser útil no melhoramento de plantas para monitorar a estabilidade do nível de ploidia, identificar haploides e duplohaploides em culturas de anteras e ovários, verificar novos níveis de ploidia em resultados de cruzamentos, detecção de indivíduos aneuploides, no estudo da apomixia, identificação do sexo em plantas dióicas, identificação de híbridos, identificação de polissomatia, acompanhamento do desenvolvimento da semente, identificação do produto de fusão de protoplastos, Dolezel (1997) . Estudos de citometria de fluxo em espécies de Brachiaria também vêm sendo realizados com o intuito de quantificar o DNA e determinar o nível de ploidia de diferentes genótipos. Letterielo et al. (1999) associaram resultados de contagens de cromossomos e de determinação do teor de DNA para certificação da ploidia em acessos de Brachiaria brizantha e mencionaram, pela primeira vez, a ocorrência de acessos pentaplóides, 2n=5x=45 nesta espécie. Também por citometria de fluxo, Penteado et al. (2000) determinaram o nível de ploidia de uma coleção de germoplasma de 435 acessos, pertencentes a 13 espécies de Brachiaria. A citometria mostrou-se muito eficaz nesta determinação, possibilitando a análise de grande número de indivíduos. Foram observados vários níveis de ploidia para as diferentes espécies, alguns poucos relatados literatura, como o caso dos pentaploides. Observou-se também grande variação nas quantidades totais de DNA, tanto entre como dentro de espécies. Para B. ruziziensis, foi determinada a quantidade de DNA de acessos diplóides e tetraplóides induzidos por tratamento com colchicina. Os resultados 31 da citometria de fluxo foram totalmente coerentes com este conhecimento prévio e mostraram que na duplicação não houve perda ou alterações nas quantidades de DNA, pois os diplóides apresentaram índice 1,00 na citometria, enquanto que nos tetraplóides esse valor variou de 1,87 a 2,18. Com base nesses dados, verificou-se que B. decumbens, B. ruziziensis, B. dictyoneura, B. platynota possuem quantidades de DNA muito semelhantes, apresentando índice 1,00 para o nível diplóide (PENTEADO et al., 2000). A mesma autora afirmou que a citometria de fluxo permitiu uma precisão e rapidez na determinação do nível de ploidia da coleção do germoplasma que consistia em 435 acesso de pelo menos 13 especies de Brachiaria, Ishigaki (2010) também utilizou da citometria de fluxo para estimar o tipo de genoma de quatro espécies de Brachiaria afirmando ser uma técnica com acuracia e eficente para esse objetivo. Este autor revelou diferentes tipos de genomas (C quantidade de DNA gametico e Cx quantidade de DNA de cada genoma), entre as cultivares, sendo que valores de C aumentaram de acordo com aumento do nível de ploidia assim como observado por Timbó (2010) . Entretanto houve uma diferença média variando de 222 a 316 Mpb nas estimativas do valor C médio entre o trabalho de Timbó (2010) , encontrando para 2x foi de 852,1 Mpb do 3x foi de 1257 Mpb e dos 4x de 1829 Mpb e o do Ishigaki et al. (2010). Provavelmente se deve as diferença nos genótipos dentro das espécies, na metodologia empregada tanto no preparo da amostra como na conversão de pg para Mpb. Já os resultados de Cx observados por Ishigaki (2010) mostrou maiores valores em cultivares apomiticas comparada com a sexual concluindo que o tipo de genoma depende também do modo de reprodução, apresentaram resultados condizentes com a conclusão. Ishigaki et al. (2009) obtiveram valores para o conteúdo de DNA de B. ruziziensis sendo: 1,41 pg para as plantas diploides e 2,77 pg para as plantas 32 tetraploidizadas e Timbó (2010) relatou a quantidade média de DNA nos acessos de B. ruziziensis foi de 1,74 pg para os genótipos 2x afirmando que essas diferenças de valores nas estimativas do conteúdo de DNA se dever a vários fatores como, por exemplo: calibração do aparelho, padrão de referência, material vegetativo, tampão de extração dos núcleos e fluorocromo utilizados. 33 REFERÊNCIAS AKIN, D. E. Histological and physical affecting digestibility of forages. Agronomy Journal, v. 21, n. 1, p. 17-25, 1989. AKIN, D. E. Rumen microbial degradation of grass tissue revealed by scanning electron microscopy. Agronomy Journal, v.65, n. 5, p.825-828,1973. AKIN, D. E.; BURDICK, D. Percentage of tissue types in tropical and temperate grass leaf blades and degradation of tissues by rumen microorganisms. Crop Science, v.15, n.5, p.661-668, 1975. 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Os genótipos 15, 27, 29, 40, 44, 53 e o 90, comportaram de maneira diferente entre épocas (plasticidade morfológica) com pelo menos quatro das nove variáveis. Já os genótipos 1, 8, 13, 14, 21, 23, 33, 43, 56, 77, 83 e o 100 comportaram de maneira semelhante nos dois ambientes de cultivo em pelo menos oito das variáveis avaliadas sendo promissos para o melhoramento que visam obter materiais em diversas condições edafoclimáticas. Exceto para espessura das epidermes abaxial (EBA) e abaxial (EDA), os genótipos apresentaram comportamento diferente para as demais características avaliadas:espessura do mesofilo (EM), diâmetro do xilema (DX), distancia entre feixes (DF), número de feixes (NF) e de células buliformes (NCB), área do tecido esclerenquimático (AES) e das células buliforme (ACB). Entretanto, os materiais apresentaram variabilidade. Palavras-chave: anatomia foliar, Brachiaria ruziziensis, melhoramento genético. 44 Abstract The study of genotype with environment interaction is of great importance for breeding programs that aim to obtain promising materials in various environments or specific environments. The objective of this work was the analysis of anatomical features in leaves of clones of B. ruziziensis cultivated in the rainy season (October to March) and dry (April-September). Fully expanded leaves, the second gem from top to basal plants were collected and fixed in FAA70 for 72h and stored in 70% alcohol. Leaf samples were evaluated at the median according to the usual procedures of plant anatomy. We made the analysis of variance and individual and the consequences for the water and dry seasons. Genotypes 15, 27, 29, 40, 44, 53 and 90, behaved differently between seasons (morphological plasticity) with at least four of the nine variables. Genotypes 1, 8, 13, 14, 21, 23, 33, 43, 56, 77, 83 and 100 produced similar results in both environmental conditions in at least eight of the variables assessed and commitments for improvements aimed at obtaining materials in various climate conditions. Except for the thickness of the abaxial epidermis (EBA) and abaxial (EDA), the genotypes showed different behavior for the other traits were: thickness of the mesophyll (MS), diameter of the xylem (DX), distance between beams (DF), number of beams (NF) and cells bulliform (NCB), area of sclerenchyma (AES) and bulliform cells (CBA). However, the materials showed variability. Keywords: leaf anatomy, Brachiaria ruziziensis, breeding 45 1. Introdução Em plantas forrageiras, a folha representa a principal fonte de matéria seca para ruminante e, por isso é um dos mais importantes órgãos da planta usados para determinar a produtividade e a qualidade de uma espécie para ser usada na nutrição animal. Ela também é o órgão da planta que apresenta alta plasticidade morfológica, ou seja, capacidade, habilidade e mudança na expressão genética em resposta a distintos ambientes (BRADSHAW, 1965; SULTAN, 2004). A plasticidade pode ser evidenciada por alterações morfológicas, fisiológicas ou bioquímicas podendo afetar características estruturais e a proporção dos tecidos da planta, notadamente na folha, tais como: espessura do mesofilo e da parede celular, número de feixes e de células buliformes, distância entre os feixes vasculares, espessura das epidermes abaxial e adaxial, densidade estomática . De acordo com Carvalho e Pires (2008), nenhum fator isolado afeta tanto a qualidade da forragem quanto a idade, embora o ambiente no qual a planta se desenvolve também desempenha papel relevante. As condições de intensidade e qualidade da luz (radiação), disponibilidade hídrica, temperatura, fotoperíodo, e diferentes condições edáficas são determinantes nas respostas do desenvolvimento das forrageiras nos diversos ambientes. Vários autores têm pesquisado a relação das características anatômicas com os fatores ambientais (ASHTON; BERLYN, 1992; CASTRO et al., 2005; MARTINS et al., 2009; MELO et al., 2007; NAPP-ZINN, 1988; NERY et al., 2007; PACIULLO et al., 2001; 2002; PINTO et al., 2007; VIEIRA, 1990; VIEIRA; MACHADO, 1992). Trabalhos vêm destacando a influência da quantidade da radiação luminosa sobre a organização dos tecidos como Vieira 46 (1995), Smith et al. (1998). Outros têm relacionado o número de feixes com as condições de disponibilidade de água (DENARDI; MACHIORI 2005). A plasticidade morfológica, segundo Via e Lande (1985) é um atributo comum das espécies que apresentam vantagens adaptativas em diversas condições edafoclimáticas, visto que as mudanças morfológicas podem facilitar na tolerância ambiental. Espera-se que plantas que ocupam ambientes heterogêneos apresentem um grande potencial plástico em suas características fisiológicas e/ou morfológicas (FUZETO; LOMÔNACO, 2000). Essa plasticidade fenotípica é detecatada pela interação genótipo x ambiente que significa diferentes respostas dos genótipos nos ambientes de avaliação. A seleção e recomendação dos genótipos mais produtivos em um programa de melhoramento é um objetivo básico que geralmente é avaliada com o desempenho dos genótipos nos diversos ambientes. Entretanto dependendo da significância da interação pode ser recomendado para os diversos ambientes (não significativa) ou para ambientes específicos (significativa), As gramíneas, em especial, têm um grande potencial na adaptação dos tecidos ao ambiente de forma a maximizar a função destes nas mais variadas condições edafoclimáticas. Dias Filho 2000; 2002 em seu trabalho com Brachiaria brizantha encontrou redução da capacidade fotossintética em ambiente sombreado, mesmo assim apresentou plasticidade morfológica e tolerância ao sombreamento. Carvalho et al. ( 2002) estudaram desempenho de seis gramíneas sob condições de luz direta e sombreada em sistema silvipastoris; somente uma não tolerou o sombreamento, apresentando menor desempenho devido a restrição de luz nesse sistema. Para os melhoristas, informações sobre o grau de plasticidade morfológica e/ ou anatômica são de extrema importância devido às diversas condições edafoclimáticas encontradas no Brasil e considerando que características anatômicas interferem na qualidade da forrageira (ALVES DE 47 BRITO et al., 1999). Paciullo (2001; 2002) estudos como estes são recentes, especialmente, quando se trata de análises comparativas das forrageiras em diferentes estações do ano. Isso enfatiza a necessidade de um aprofundamento de trabalhos dessa natureza, já que há escassez de pesquisadores atuando nessa área, principalmente que analisem a estrutura anatômica foliar em diferentes tipos de clima (PACIULLO et al., 2002). Este trabalho teve por objetivos avaliar as características anatômicas de genótipos de B. ruziziensis, nas épocas chuvosa e seca do ano, e identificar aqueles com potencial para uso no programa de melhoramento de plantas. 2. Material e Métodos Foram avaliados 38 genótipos de Brachiaria ruziziensis oriundos do programa de melhoramento desta espécie, desenvolvido pela Embrapa Gado de Leite Juiz de Fora-MG, em parceria com a Universidade Federal de Lavras UFLA, Lavras, MG. Esses materiais foram cultivados no Campo Experimental de Coronel Pacheco (MG), onde esta localizada a Estação Climatológica da Embrapa Gado de Leite Juiz de Fora MG. Os dados climáticos (luminosidade, temperatura, insolação, umidade e precipitação), cujos valores médios estão apresentados na Tabela 1, foram obtidos junto à Estação Meteorológica situada no Campo Experimental de Coronel Pacheco (MG) da Embrapa Gado de Leite. 48 Tabela 1 Variáveis climáticas médias observadas no período experimental. Dados fornecidos pela Estação Climatológica do Campo Experimental de Coronel Pacheco (MG) da Embrapa Gado de Leite. Meses/Ano Umidade Relativa (%) Temperatura (ºC) Insolação (hora/mês) Luminosidade (watt/m²) Precipitação (mm/Mês) jan/09 92,50 24,08 183,75 621,25 38 fev/09 89,61 24,15 207,68 642,14 118 mar/09 88,00 24,69 215,75 645,00 42,4 abr/09 87,67 20,20 214,67 621,67 0,2 mai/09 91,29 19,18 149,94 578,71 3,8 jun/09 90,13 17,22 153,77 553,33 37,6 jul/09 88,97 18,92 158,23 561,13 3,2 ago/09 86,16 18,64 164,90 589,19 4,2 set/09 84,33 22,08 192,63 609,83 113,4 out/09 89,26 22,23 159,21 600,00 58 Foram realizadas coletas de amostras de forragem de cada um dos materiais genéticos em duas épocas do ano de 2009, sendo uma realizada em 12 de março (44 dias), representativa da estação das águas (outubro a março) e a outra realizada em 31 de agosto (126 dias), representativa da estação da seca (abril a setembro). As datas mais próximas de realização dos cortes de avaliação do potencial produtivo e da qualidade da forragem que foram 27/01/2009, 16/03/2009 (48 dias), 27/04/2009 e 19/10/2009 (175 dias). No total foram realizados 8 cortes de avaliação. Foram coletadas três folhas completamente expandidas localizadas na segunda gema do ápice para base no perfilho de cada genótipo. Estas folhas foram fixadas em F.A.A70 (formaldeído: ácido acético glacial: álcool etílico) por 72 horas (KRAUS; ARDUIM, 1997) e posteriormente preservadas em etanol 70% até a data das análises. Utilizou-se micrótomo de mesa para obtenção de secções transversais do terço médio foliar. As secções foram clarificadas em 49 solução de hipoclorito de sódio 50%, sendo, em seguida, lavadas em água destilada, neutralizadas em água acética 1%, coradas com azul de astra-safranina (KRAUS; ARDUIN, 1997) e montadas em glicerina 50%. Nas secções transversais das lâminas foliares, a partir de imagens capturadas por uma câmera acoplada a um microscópio, foram avaliadas as seguintes características: espessura do mesofilo (EM), espessura da epiderme abaxial (EBA) e adaxial (EDA), diâmetro do xilema (DX), distância entre os feixes vasculares (DF), número de feixes (NF), número de células buliformes (NCB), área das células buliformes (ACB), área do tecido esclerenquimático (AES) (Figura 1). As medições foram realizadas em uma área selecionada entre o primeiro e o segundo feixes vasculares maiores subseqüentes, tendo o feixe central como referência (Figura 1), os quais também foram avaliados. O número de repetições das observações do campo para cada folha variou para cada característica analisada. Para avaliar a espessura da epiderme nas faces abaxial e adaxial, assim como do mesofilo, fora, feitas mensurações em três regiões distintas de cada secção, com auxílio do software Image tool®, perfazendo um total de nove repetições por folha.Para as demais características, foram também observados duas regiões distintas de cada campo totalizando em seis repetições. 50 Figura 1 - Fotomicrografias esquemáticas representando a padronização das medições A) As setas representam as medições das espessura das epidermes abaxial e adaxial (EBA e EDA) (preta), EM (vermelha) e diâmetro do xilema (DX) (branca). B) As setas e o número (preto) indicam as medições do distancia entre feixes (DF) e número de feixes (NF), respectivamente; o número (vermelho) indica o número de células buliformes (NCB). C) Área das células buliformes (ACB). D) Área do tecido esclerenquimático representada em vermelho escuro AES. 1 ACB C D 1 2 3 2 3 B A 51 Os dados anatômicos foram submetidos à análise de variância individual (por estação), considerando um delineamento inteiramente casualizado. Procedeu-se à analise conjunta de acordo com o seguinte modelo estatístico: O modelo estatístico adotado foi: Yijkl = µ + gi + ej + geij + fk(ij) + cl(ijk) Yijk = é a observação do genótipo i, na época j, na folha k, no corte l µ = é a média geral; gi = é o efeito fixo do genótipo i; ej = é o efeito fixo da época j; geij = é o efeito fixo da interação do genótipo i com a época j. fk(ij) = é o efeito da folha k dentro da interação genótipo com a época. cl(kij) = é o efeito do corte l dentro da folha k dentro da interação genótipo com a época. Para as comparações entre as médias dos genótipos utilizou-se o teste de agrupamento Scott-Knott com 5% de probabilidade (Ramalho et al., 2007). As análises foram realizadas com o auxílio do software SISVAR. A qualidade experimental foi aferida pela estimação do parâmetro acurácia seletiva (RESENDE; DUARTE,2007). 3. Resultados e Discussão Na análise de variância individual (por época) apenas a AES não houve efeito significativo dos genótipos na época da seca (p>0,05). Para as demais características houve efeito significativo dos genótipos na análise em cada época (Tabelas 2 e 3). Na análise de variância conjunta de épocas ( águas e seca ) para todas as características avaliadas, o comportamento dos genótipos foi significativo (p<0,01) (Tabelas 4 e 5) . Estas informações confirmam que os 52 genótipos apresentam variabilidade genética para as características anatômicas das folhas, que poderá ser explorada pelo melhoramento genético. Exceto para NF, o qual apresentou acurácia moderada de 69,02% para o efeito dos genótipos, para as demais características avaliadas, a precisão experimental foi considerada alta, variando de 74,92% até 89,82%, conforme critérios de Resende e Duarte, (2007). Quando se trata de intensidade luminosa, um grande número de trabalhos leva em consideração as variações na estrutura foliar (GIVNISH, 1988; VOGELMANN et al., 1996). Segundo Dickson (2000), a folha é o órgão da planta que mais responde anatomicamente às variações lumínicas de um determinado habitat. Esse mecanismo de alteração fenotípica de acordo com as condiçoes ambientais é denominado de plasticidade morfológica. Diversos autores definem a plasticidade morfológica como a habilidade de um organismo alterar sua fisiologia e/ou morfologia em decorrência dessa interação genótipo com ambiente (BRADSHAW, 1965; SCHILICHTING, 1986; STEARNS, 1989; SCHEINER 1993). Para as espessuras das epidermes (EBA e EDA) não foi observada diferença significativa entre épocas na análise conjunta (p>0,05), contudo foi observada interação genótipo com ambiente (p<0,05) (Tabelas 4, 5 e 6) (Tabela 4). O efeito das épocas (diferença entre épocas) para os genótipos 2, 27, 29, 40, 53, 54, 64, 71 e 97 foi significativo para EBA (p<0,01) (APÊNDICES A e B). Destes, os genótipos 29 e o 71 apresentaram as maiores médias na época da seca, com 5,38 µm e 7,13 µm, respectivamente. Para os demais, as médias foram superiores na época das águas (APENDICES A e B). Em relação a EDA, os genótipos que tiveram efeito significativo entre épocas e apresentaram médias superiores estação das água, são eles: 2, 27, 54 e o 97 (p<0,05), com médias de 7,60 , 7,55, 8,08 e 6,75 µm, respectivamente (APENDICE A e B). 53 Tabela 2 Resumo da ANAVA individual por época, águas e seca , para as variáveis: espessura das epidermes abaxial - µm, (EBA) e adaxial - µm (ADA), espessura do mesofilo - µm (EM), distância entre os feixes - µm (DF) e diâmetro do xilema µm (DX). *GL-Grau de liberdade; **QM- Quadrado Médio : ***p grau de significância. Tabela 3 Resumo da ANAVA individual por época, águas e seca , para as variáveis: espessura das epidermes abaxial - distância entre os feixes - µm (DF), número de feixes (NF) e células buliformes (NCB), área do de tecido esclerenquimático - µm² (AES) e área da célula buliforme - µm² (ACB). *GL-Grau de liberdade; **QM- Quadrado Médio : ***p grau de significância. EBA EDA EM DX Época GL* QM** p*** QM P QM P QM p Água 37 1.93 <.0001 1.50 <.0001 527.76 <0.05 28.86 <.0001 Seca 37 1.51 <.0001 1.04 <.0001 756.24 <.0001 31.58 <.0001 DF NF NCB AES ACB Época GL* QM** p*** QM p QM p QM p QM p Água 37 29.75 >0.001 0.20 <0.05 0.26 0.00 3435778.00 <.0001 613076.00 <0.05 Seca 37 64.72 <.0001 0.22 <0.05 0.29 0.00 1164809.00 >0.05 1595476.00 <.0001 54 Tabela 4 Resumo da ANAVA conjunta para espessura das epidermes abaxial - µm, (EBA) e adaxial - µm (ADA), espessura do mesofilo- µm (EM) e diâmetro do xilema µm (DX) nas épocas das águas e da seca dos 38 genótipos de Brachiaria ruzizensis em 2009. *G = Efeito dos Genótipos; **E =Efeito de épocas( águas e seca );*** G*E. Tabela 5 Resumo da ANAVA conjunta para espessura das epidermes abaxial - distância entre feixes - µm (DF), número de feixes (NF) e células buliformes (NCB), área do tecido esclerenquimático- µm² (AES) e área de células buliformes - µm² (ACB) nas épocas das águas e da seca dos 38 genótipos de Brachiaria ruzizensis em 2009. *G = Efeito dos Genótipos; **E =Efeito de épocas( águas e seca );*** G*E. EBA EDA EM DX FV GL QM P QM P QM P QM P G* 37 1.86 <0.01 1.64 <0.01 873.01 <0.01 45.59 <0.01 E** 1 1.75 >0.05 1.46 >0.05 14706.99 <0.01 2582.43 <0.01 G*E 37 1.57 <0.01 0.88 <0.01 410.99 <0.05 14.84 >0.05 DF NF NCB AES ACB FV GL QM P QM p QM p QM p QM p G* 37 69,25 <0,01 0,25 <0,01 0.32 <0,01 2464259,91 <0,01 1309206,73 <0,01 E** 1 80,85 <0,05 4,58 <0,01 3.86 <0,01 47010000,3 <0,01 29609052,68 <0,01 G*E*** 37 25,21 <0,01 0,16 >0,05 0.22 <0,05 2136327,06 <0,01 899345,1 <0,01 55 Observando os dados climáticos da Tabela 1, podemos constatar que os resultados obtidos para EBA e EDA, maiores nas épocas das águas que na seca, são coincidentes com a literatura. No mês de março (época das águas), os níveis de insolação hora/dia a luminosidade foram superiores aos observados no mês de agosto (época da seca). A variação das faces da epiderme é diferenciada em relação às variações na intensidade luminosa, podendo diminuir (DICKINSON, 2000; GRATANI et al., 2006; PANDEY; KUSHMAHA, 2005) ou aumentar (MORAIS et al., 2004; VOLTAN et al., 1992). Considerando a variável EM, na análise conjunta houve diferença entre as épocas de cultivo (p<0,05) com maior média na seca comparada com as águas e também houve interação genótipo com ambiente (Tabela 4 e 6). Os genótipos 4, 6, 15, 29, 35, 40, 41, 44, 90, 93 e 97 (FIGURAS 2A D) também apresentaram médias de magnitudes superiores na época da seca comparada com às águas, com valor médio de 170,68 µm (APÊNDICES A e B). A espessura do mesofilo pode ter sido influenciada (p<0,05) pelas condições de luminosidade e insolação, apresentando maior valor para a folhas no cultivo das águas (Tabelas 4 e 6). Os resultados obtidos neste estudo não foram coincidentes com os encontrados na literatura, quando se considera as respostas esperadas frente aos índices de temperatura, insolação e luminosidade dos meses de agosto e março (Tabela1). O mesofilo tem a propriedade de absorção uniforme da luz que incide nas folhas. Para várias espécies, tem sido observado que as plantas, quando cultivadas em pleno sol, apresentam folhas bastante espessas devido ao desenvolvimento dos parênquimas paliçádico e esponjoso, o qual é induzido pela alta intensidade de luz, acarretando um aumento da área do mesofilo (ABRAMS et al., 1994; BOARDMAN, 1977; CUI et al., 1991; LEE et al., 2000). 56 Figura 2 Fotomicrografias de secções transversais (Objetiva de 20x) dos genótipos 41 (A e B) e 29 (C e D) representando a diferença da espessura do mesofilo entre as épocas das águas (A e C) e da seca (B e D). Quanto ao tecido esclerenquimático (AES), na análise conjunta observou-se diferença entre épocas com a maior média na época das águas e também interação do genótipo com ambiente (Tabelas 5 e 6). O maior efeito ambiental é provocado pela temperatura sob a qual a planta acelera seu desenvolvimento, além da lignificação da parede celular também há o aumento na proporção dos tecidos lignificados (ALVES DE BRITO et al., 1999; JUNG, 1989; PACIULLO et al., 2002 ; WILKINS, 1972;). Segundo Akin e Burdick (1973), os sítios de lignificação podem ser mais importantes que a quantidade de lignina presente na planta. Sua constituição predominante é a lignina, principal fator limitante da digestibilidade. Nove genótipos (3, 41, 44, 51, 58, 64, 66, 99, 100) apresentaram comportamentos distintos entre épocas, com médias superiores nas águas (p<0,05) (APÊNDICES A e B) (Figura 2 A-F). Neste A B C D 57 período, a temperatura, a insolação e a luminosidade foram maiores do que na época da seca (Tabela 1). X 3 seca Figura 3 Fotomicrografias de secções transversais (Objetiva de 20x) dos genétipos 27 (A e B); 40 (C e D) e 41 (D e F) representando a diferenaça da área do esclerênquima entre as épocas da águas (A, C e E) e da seca (B, D e F). Na análise conjunta, o número de células buliformes (NCB) apresentou diferença significativa entre épocas (p<0,05) com média de magnitude superior nas águas comparada com a seca, sendo a interação do genótipo com ambiente também significativa (p<0,05) (Tabela 5 e 6). A B C D E F 58 Constatando o efeito de épocas dentro de genótipos para NCB (Figura 2B), o genótipo 27 (na época da seca ) com a média de 5,33 e os genótipos 15, 53, 70, 90, 93 e 96 (na época das águas ), com valor médio de 5,35, apresentaram diferenças (p<0,05) entre as épocas (APÊNDICES A e B). Já a área dessas células (ACB) (Figura 4 A-D), em cada um dos treze genótipos (4, 6, 15, 21, 29, 40, 44, 48, 51, 54, 64 , 90 e 93 ) na seca , as médias foram maiores comparadas às águas (p<0,05) (APÊNDICES A e B). Figura 4 Fotomicrografias de secções transversais (Objetiva de 20x) dos genótipos 18 (A e B) e 7 (C e D); representando a diferença da área das células buliformes entre as épocas da águas (A e C) e da seca (B e D). A presença das células buliformes foi constatada somente na parte adaxial, o que é comum em gramíneas (ELLIS, 1976). Os genótipos 8, 43, 44 e 58 formaram um agrupamento como as menores médias (4,38) (p<0,05) de NCB comparado com os demais. Já para ACB, foram formados dois grupos, sendo que o grupo com maiores médias foi composto por 14 genótipos, (2, 6, 7, 8, 21, 35, 40, 43, 51, 54, 56, 58, 64 e 97). Esta é uma das características que A B C D 59 pode ser usada como bom indicador do cultivo em ambientes com déficit hídrico ou altas temperaturas, pois as células buliformes estão envolvidas com o mecanismo de enrolamento foliar, de modo a diminuir superfície à perda de água por transpiração. Portanto, quanto maior a área de células buliformes, melhor a resposta do genótipo em relação às condições ambientais supra-citadas. Em um trabalho de Melo (2007), plantas de Paspalum submetidas às condições de deficiência hídrica tiveram grupos de células buliformes com um maior tamanho em altura quando comparadas às plantas do tratamento controle. Estes resultados corroboram com os obtidos neste estudo em que se observou maior área de células buliformes no cultivo na seca , período em que é necessário maior economia/aproveitamento de água pela planta devido a menor precipitação (Tabela 1). Para o diâmetro dos vasos do metaxilema foi constada maior média na epoca das águas com resultados significativos na análise conjunta (Tabela 4 e 6). Não foi observada interação do genótipo com ambiente (p>0,05) (Tabela 4). Cerca de 65% dos genótipos apresentaram diferenças avaliadas entre épocas ( águas e seca ), para a característica DX (Figuras 5 A-D), sendo todos com médias superiores nas águas (APÊNDICE A). O diâmetro dos vasos do metaxilema também é um importante fator no fluxo de água, pois vasos com calibre maior são mais propensos à cavitação do que os de calibre menor (VASELLATI et al., 2001). Dickison (2000) estudou diversas espécies e afirmou que a freqüência de vasos maior por milímetro quadrado dá mais segurança contra o embolismo em plantas que ocorrem em ambientes de condições secas. O teste Scott Knott resultou em três agrupamentos, sendo que o grupo com média inferior para o DX foi formado pelos genótipos 33, 48, 66 e o 93. Portanto, considerando o calibre do xilema, esses genótipos são interessantes para avaliação de cultivo na época da seca. 60 Tabela 6 Médias da ANAVA para as variáveis: espessura das epidermes abaxial -µm, (EBA) e adaxial - µm (ADA), espessura do mesofilo - µm (EM), distância entre feixes - µm (DF), número de feixes (NF) e células buliformes (NCB), área do tecido esclerenquimático - µm² (AES) e área de células buliformes - µm² (ACB) nas épocas das águas e da seca dos 38 genótipos de Brachiaria ruzizensis em 2009. *Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem pelo teste de F. Época EBA EDA EM DX DF NF NCB AES ACB Seca 6,37 a* 5,90 a 157,99 a 22,09 b 25,17 a 4,87 b 4,77 b 3437,13 b 4254,75 a Água 6,54 a 6,06 a 141,92 b 28,82 a 23,98 b 5,15 a 5,03 a 4345,28 a 3534,01 b 61 De acordo com Baas e Schweingruber (1987); Carlquist (1988); Alves e Angyalossy-Alfonso (2000), os fatores ambientais afetam as dimensões e até mesmo o arranjo dos elementos vasculares. Quando a planta está sujeita a algum tipo de estresse, a diminuição dos vasos condutores pode garantir um aumento na segurança do transporte de água, uma vez que fatores como seca, inundação, altitude, latitude, constituição e fertilidade do solo, estádios sucessionais da vegetação e poluição podem alterar significativamente sua estrutura anatômica (BAAS, 1983; BAAS; SCHWEINGRUBER, 1987; CARLQUIST; HOEKMAN, 1985). Esse comportamento parece ter sido observado nos genótipos avaliados na época da seca, os quais apresentaram menor diâmetro de feixes do xilema. Neste período, os genótipos sofreram com a escassez hídrica, pois a precipitação média em agosto/2009 foi de 0,14 mm (Tabela 1). Segundo Baas et al. (1983), vasos de maior diâmetro são mais eficientes, porém menos seguros devido ao maior risco de aparecimento de bolhas. Figura 5 Fotomicrografias de secções transversais (Objetiva 20x) do genótipo 15 (A e B) genótipo 83 (C e D) representando a diferença entre as épocas do diâmetro do xilema entre as épocas das águas (A e C) e da seca (B e D). A B C D 62 A distância entre feixes na análise conjunta apresentou a média superior na seca em relação às águas e também interação do genótipo com ambiente (Tabelas 5 e 6). Com exceção do genótipo 13, na época das águas, com média de 26,18 µm (p<0,05) para DF (Figura 6 A-B), os genótipos 7, 14, 29, 53 e 70 apresentaram valores superiores no cultivo na seca, variando de 30,99 µm até 39,3 µm (APENDICE A). Os dados climáticos observados no período do experimento (Tabela 1) mostram menores níveis de insolação e luminosidade na época da seca. Resultados semelhantes foram obtidos por Gobbi (2007) também em folhas de Brachiaria, em que a distância entre os feixes aumentou diretamente de acordo com os níveis de sombra. A distância entre os feixes pode estar relacionada com o transporte e a distribuição mais eficiente de carboidratos e água para as células do mesofilo. Uma menor distância condiciona uma translocação de fotossintatos e maior distribuição de água em ambientes com restrição hídrica e altas temperaturas. Como a B. ruziziensis apresenta baixo crescimento no período da seca, os genótipos, 2, 9, 13, 15, 16, 86, 95 e o 97 com menor distância entre feixes podem apresentar vantagens para uso nos programas de melhoramento genético pelo fato da distribuição de água e sais minerais ser potencialmente mais eficaz e, consequentemente, podendo otimizar a produção. Essa mesma consideração pode ser feita para àqueles genótipos (2, 8, 13, 14, 15, 35, 43, 44, 58, 96, 100) que apresentaram maior número de feixes. Na análise conjunta para o número de feixes foram observadas médias de maior valor nas águas além da interação significativa do genótipo com ambiente (Tabelas 5 e 6). Ao avaliar o número de feixes NF entre épocas, a maior média foi observada para o genótipo 27 (5,44), no período da seca, quando os níveis de luminosidade e insolação foram inferiores aos observados na época das águas (Tabela 1) . Os genótipos 15, 40, 48, 53, 90 e 96 , 63 apresentaram médias diferentes com magnitudes superiores nas águas (APÊNDICE A). Figura 6 Fotomicrografias de secções transversais (Objetiva 10x) do genotipo 15 representando as diferença de numero de feixes e celulas buliformes entre as épocas das águas (A) da seca (B). Os programas de melhoramento visam obter genótipos mais produtivos que podem ser cultivados em diversas condições edafoclimáticas, ou seja, não apresente a plasticidade fenotípica que é identificada pela interação genótipo com ambiente. Em espécies perenes como a Brachiaria ruziziensis um dos objetivos é obter materiais com comporamento uniforme em ambas estações, e não em ambientes específicos como águas e seca representado pela significância da interação genótipo com ambiente. Nas figuras 7 e 8 demonstram os genótipos (15, 27, 29, 40, 44, 53 e o 9) com um maior número de características adaptáveis a ambientes específicos (águas e seca), ou seja, apresentaram comportamento distindo entre as duas épocas. para, pelo menos, quatro das nove variáveis analisadas. Os genótipos 1, 8, 13, 14, 21, 23, 33, 43, 56, 77, 83 e o 100 apresetaram uma ou nenhuma interação genótipo com ambiente significativa das nove variáveis analisadas. 1 2 3 4 5 1 2 3 4 A B 64 Figura 7 Representação do comportamento dos genótipos 1, 8, 13, 14, 15, 21, 23, 27, 29, 33, 40, 43, 44, 53, 56, 77, 83, 90 e o 100 na época das águas: diâmetro do xilema (XILE), distância entre feixes (DF), número de feixes (NF), número de células buliformes (NCB), área do tecido esclerenquimático (AES), área das células buliformes (ACB), espessura da epiderme abaxial e adaxial (EBA E EDA) e espessura do mesofilo (MES). 65 Figura 8 Representação do comportamento dos genótipos 1, 8, 13, 14, 15, 21, 23, 27, 29, 33