EMERSON JOSUE MARTINEZ JIMENEZ FERMENTAÇÃO ANAERÓBICA AUTOINDUZIDA (SIAF) COM E SEM INOCULAÇÃO DE LEVEDURAS: VIABILIDADE DA SEMENTE, COMPOSIÇÃO QUÍMICA E QUALIDADE SENSORIAL DO CAFÉ LAVRAS-MG 2023 EMERSON JOSUE MARTINEZ JIMENEZ FERMENTAÇÃO ANAERÓBICA AUTOINDUZIDA (SIAF) COM E SEM INOCULAÇÃO DE LEVEDURAS: VIABILIDADE DA SEMENTE, COMPOSIÇÃO QUÍMICA E QUALIDADE SENSORIAL DO CAFÉ Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos, área de concentração em Ciência dos Alimentos, para obtenção do título de Doutor. Profa. Dra. Rosane Freitas Schwan Orientadora Prof. Dr. Disney Ribeiro Dias Dra. Nádia Nara Batista Dra. Stella Veiga Franco da Rosa Coorientadores LAVRAS-MG 2023 Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema de Geração de Ficha Catalográfica da Biblioteca Universitária da UFLA, com dados informados pelo(a) próprio(a) autor(a). Martinez Jimenez, Emerson Josue. Fermentação anaeróbica autoinduzida (SIAF) com e sem inoculação de leveduras: Viabilidade da semente, composição química e qualidade sensorial do café / Emerson Josue Martinez Jimenez. - 2023. 108 p.: il. Orientador(a): Rosane Freitas Schwan. Coorientador(a): Disney Ribeiro Dias, Nádia Nara Batista, Stella Veiga Franco da Rosa. Tese (doutorado) - Universidade Federal de Lavras, 2023. Bibliografia. 1. Fermentação de café. 2. Viabilidade da semente e qualidade do café. 3. Inoculação de leveduras. I. Schwan, Rosane Freitas. II. Dias, Disney Ribeiro. III. Batista, Nadia Nara. IV. Franco da Rosa, O conteúdo desta obra é de responsabilidade do(a) autor(a) e de seu orientador(a). EMERSON JOSUE MARTINEZ JIMENEZ FERMENTAÇÃO ANAERÓBICA AUTOINDUZIDA (SIAF) COM E SEM INOCULAÇÃO DE LEVEDURAS: VIABILIDADE DA SEMENTE, COMPOSIÇÃO QUÍMICA E QUALIDADE SENSORIAL DO CAFÉ SELF-INDUCED ANAEROBIOSIS FERMENTATION (SIAF) WITH AND WITHOUT YEAST INOCULATION: SEED VIABILITY, CHEMICAL COMPOSITION AND COFFEE SENSORIAL QUALITY Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos, área de concentração em Ciência dos Alimentos, para obtenção do título de Doutor. APROVADA em 04 de julho de 2023 Dra. Patrícia Campos Bernardes UFES Dra. Cíntia Lacerda Ramos UFVJM Dr. Marlon Enrique López Torres FHIA Dra. Beatriz Ferreira Carvalho UFLA Dra. Silvia Juliana Martínez Gelvez UFLA Profa. Dra. Rosane Freitas Schwan Orientadora Prof. Dr. Disney Ribeiro Dias Dra. Nádia Nara Batista Dra. Stella Veiga Franco da Rosa Coorientadores LAVRAS-MG 2023 A Deus, por sempre estar comigo em toda minha caminhada Dedico AGRADECIMENTOS A Deus, pela graça de seu amor incondicional que sempre estive comigo durante este caminho chamado vida. A minha Esposa Jeaneth Eduviges Zelaya Molina, por me acompanhar neste logro, por sua companhia e sua fortaleza para lutar juntos durante este desafio. À Organização de Estados Americanos (OEA) pela apertura de bolsas de estudos para programas de pós-graduação. Ao Governo de Brasil por abrir as portas acadêmicas, cientificas e culturais para promover o crescimento científicos dos países em desenvolvimento. À Universidade Federal de Lavras, por minha formação acadêmica e cientifica. Ao Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos (PPGCA), pela oportunidade de ingressar em um curso de excelência acadêmica internacional. A minha orientadora, Profa. Dra. Rosane Freitas Schwan, por depositar sua confiança em mim, e permitir-me ser parte de seu grupo de pesquisa e aprender ciência. Aos coorientadores Dra. Nádia Batista e o Dr. Disney Dias pela coorientação, correções, paciência e compreensão. Aos meus colegas de laboratório e ao Núcleo de Estudos em Fermentações (NEFER). A minha colega Dra. Pâmela Martins por seu apoio incondicional durante este caminho, sem sua ajuda o caminho seria muito mais difícil. A aqueles colegas de laboratório que me brindaram sua amizade sendo um estrangeiro ajudando a sentir-me em casa (Rafael, Carlos, Manuel, Lucas, Pâmela, Andreisa, Iara, Dirceu, Cidinha, Ivani, Angélica) obrigado por sua amizade que foi fundamental para alcançar este objetivo. À profa. Dra. Stella Rosa pelo assessoramento e disponibilidade para o desenvolvimento da pesquisa no laboratório central de sementes da UFLA. As Dras. Ana Luiza de Oliveira e Janaína Ribeiro por sua colaboração no desenvolvimento da pesquisa na área da fisiologia das sementes. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo apoio financeiro. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. RESUMO GERAL A fermentação do café ocorre devido a produção de metabolitos produzidos por microrganismos epifíticos presentes no próprio fruto e são transferidos ´para o interior do grão. Além disso, durante a fermentação, processos metabólicos de germinação são iniciados dentro da semente, afetando a viabilidade do embrião, a composição química e a qualidade sensorial do café. Nesse contexto, nosso objetivo foi avaliar os efeitos da fermentação do café na viabilidade das sementes e na qualidade sensorial da bebida utilizando leveduras como culturas iniciadoras (Saccharomyces cerevisiae CCMA 0543, Candida parapsilosis CCMA 0544 e Torulospora delbrueckii CCMA 0684), por fermentação anaeróbica induzida (SIAF) em Coffea arabica L. variedade Topazio amarelo, por processamento natural e despolpado. Monitoramento das leveduras foi realizado por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR), análise de ácidos orgânicos (cítrico, málico, succínico e lático) e açúcares (sacarose, glicose e frutose) por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Compostos voláteis por cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS). A viabilidade e os danos das sementes foram monitorados por teste de tetrazólio, condutividade elétrica, teste de germinação de sementes e análise enzimática por eletroforese em gel (catalase, álcool desidrogenase, esterase e isocitrato liase). As leveduras S. cerevisiae e T. delbrueckii apresentaram as maiores populações durante a fermentação em comparação com o tratamento de controle SIAF e o processo convencional sem inoculação. Observou-se diminuição na concentração de açúcares (sacarose, glicose e frutose) e ácidos (cítrico, málico e succínico). Os tratamentos processados pelo SIAF apresentaram produção de ácido lático no final da fermentação (o tratamento controle SIAF apresentou a maior produção com 8,33 g/kg no café descascado e 3,95 g/kg no café natural). Enzimas chave dos processos metabólicos de germinação (isocitrato liase e endo- β-mananase) demonstraram o início da germinação durante a fermentação do café, bem como processos de defesa contra estresse oxidativo (esterase e catalase) e ambiental (anaerobiose determinado por álcool desidrogenase). Alterações na qualidade fisiológica das sementes foram identificadas, incluindo diminuição da viabilidade embrionária pelo teste de tetrazólio (o tratamento inoculado com S. cerevisiae foi o tratamento com menor % de viabilidade embrionária, com 52,5 no café natural e 60,0 no café despolpado). O tratamento convencional processado com café natural não apresentou diminuição na % de germinação das sementes. Todos os cafés obtiveram notas superiores a 80 pontos. Os cafés com maior pontuação sensorial foram obtidos de inoculados e fermentados pelo SIAF; levedura T. delbrueckii (86,50) em café despolpado e levedura C. parapsilosis (85,90) em café natural. Os cafés fermentados pelo SIAF foram caracterizados pelos aromas e sabores cítricos, caramelo, mel, chocolate e castanha. O processo de fermentação do café por SIAF com inoculação de levedura afetou a viabilidade do grão de café, mas não a qualidade sensorial da bebida, indicando que a utilização de starters de levedura pelo método SIAF favorece a produção de cafés especiais com características sensoriais diferenciadas. Palavras-chave: Inoculação. Leveduras. Cafés especiais. Fisiologia de Sementes. Qualidade sensorial. SIAF. GENERAL ABSTRACT Coffee fermentation occurs due to the production of metabolites produced by epiphytic microorganisms present in the fruit itself and transferred to the interior of the grain. In addition, during fermentation, germination metabolic processes are initiated within the seed, affecting the embryo's viability, the chemical composition, and the sensory quality of the coffee. In this context, our objective was to evaluate the effects of coffee fermentation on seed viability and sensory quality of the beverage using yeast as starter cultures (Saccharomyces cerevisiae CCMA 0543, Candida parapsilosis CCMA 0544 and Torulospora delbrueckii CCMA 0684), by induced anaerobic fermentation (SIAF) in Coffea arabica L. Variety Yellow Topaz, by natural and pulped processing. Yeast monitoring was performed by real-time polymerase chain reaction (qPCR), analysis of organic acids (citric, malic, succinic, and lactic) and sugars (sucrose, glucose, and fructose) by high-performance liquid chromatography (HPLC). Volatile compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Seed viability and damage were monitored by tetrazolium test, electrical conductivity, seed germination test, and enzymatic analysis by gel electrophoresis (catalase, alcohol dehydrogenase, esterase, and isocitrate lyase). Yeasts S. cerevisiae and T. delbrueckii showed the highest populations during fermentation compared with the control SIAF treatment and the conventional process without inoculation. A decrease in the concentration of sugars (sucrose, glucose, and fructose) and acids (citric, malic, and succinic) was observed. Treatments processed by SIAF showed lactic acid production during the end of fermentation (the control treatment SIAF showed the highest production with 8.33 g/kg in pulped coffee and 3.95 g/kg in natural coffee). Key enzymes of the metabolic processes of germination (isocitrate lyase and e endo-β-mannanase) demonstrated the beginning of germination during coffee fermentation, as well as processes of defense against oxidative (esterase and catalase) and environmental stress (anaerobiosis determined by alcohol dehydrogenase). Changes in seed physiological quality were identified, including decreased embryonic viability by tetrazolium test (the treatment inoculated with S. cerevisiae was the treatment with the lowest % embryonic viability, with 52.5 in natural coffee and 60.0 in pulped coffee). The conventional treatment processed by natural coffee did not show a decrease in the % of seed germination. All coffees obtained scores greater than 80 points. The coffees with the highest sensory score were obtained from inoculated and fermented by SIAF; yeast T. delbrueckii (86.50) in pulped coffee and yeast C. parapsilosis (85.90) in natural coffee. Coffees fermented by SIAF were characterized by aromas and flavors of citrus, caramel, honey, chocolate, and chestnut. The coffee fermentation process by SIAF with yeast inoculation affected the viability of the coffee bean but not the sensory quality of the drink, indicating that the use of yeast starters by the SIAF method favors the production of special coffees with differentiated sensory characteristics. Keywords: Inoculation. Yeasts. Specialty coffees. Seed Physiology. Sensory quality. SIAF. SUMÁRIO PRIMEIRA PARTE ......................................................................................... 9 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 9 2. REFERENCIAL TEÓRICO ......................................................................... 10 2.1. Generalidade do café ...................................................................................... 10 2.2. Qualidade do café ........................................................................................... 11 2.3. Processamento pós-colheita do café .............................................................. 12 2.3.1. Influência do método de processamento ...................................................... 14 2.4. Anatomia e composição química do café ...................................................... 16 2.5. Influência do processamento na química do café ........................................ 17 2.5.1. Compostos voláteis e não voláteis no café .................................................... 18 2.6. Leveduras e seu comportamento durante a fermentação do café ............. 18 2.7. Fermentação Anaeróbica Autoinduzida (SIAF) .......................................... 20 2.8. Uso de Cultivos Iniciadores ........................................................................... 20 2.9. Respostas metabólicas dos grãos de café durante o processamento .......... 21 2.9.1. Atividade enzimática durante a pós-colheita do café .................................. 22 3. CONSIDERAÇÕES GERAIS ....................................................................... 23 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 24 SEGUNDA PARTE: ARTIGOS ..................................................................... 8 ARTIGO 1: Influence of anaerobic fermentation and yeast inoculation on the viability, chemical composition, and quality of coffee ..................... 32 ARTIGO 2: Self-induced anaerobic fermentation in coffees inoculated with yeasts and its impact on seed viability and sensory quality of the beverage. .......................................................................................................... 72 9 PRIMEIRA PARTE 1 INTRODUÇÃO O Brasil é o maior produtor e exportador de café no mundo, na safra 2021/22, produziu 60.4 milhões de sacas de café, seguido pelo Colômbia, Etiópia, Honduras e Peru (OIC, 2023). Além da produção os consumidores estão constantemente em busca de cafés de boa qualidade, devido ao grande crescimento e disponibilidade dos cafés especiais o qual gera uma alta demanda dos consumidores (CÓRDOBA et al., 2021). Além disso a qualidade do café é definida por fatores intrínsecos e extrínsecos como: genética da planta, estado de maturação do fruto, condições ambientais, práticas agrícolas, clima (temperatura, umidade, precipitação e vento), altitude, disponibilidade de luz, técnicas de pós-colheita, (ABREU et al., 2017; HAILE; KANG, 2019). Desta forma o processamento pós-colheita é um dos fatores onde o produtor pode influenciar a qualidade do café, dependendo do método de processamento: seco, semisseco e úmido, os quais utilizam diferentes técnicas e tecnologias com e sem utilização de água, para a retirada da casca e mucilagem do café, obtendo dessa forma o grão de café (BOREM, 2008; BRANDO; BRANDO, 2015). Assim durante a pós-colheita é desenvolvida uma fermentação no café caracterizada pela presença de diferentes grupos microbianos tais como bactérias, fungos e leveduras. Dessa maneira estes microrganismos através da fermentação consumem os nutrientes disponíveis, produzindo metabólitos e enzimas que influenciam na qualidade do café, através do intercambio de compostos do exterior para o interior do grão do café (HADJ SALEM et al., 2020; SCHWAN et al., 2022; SILVA et al., 2013). Nos últimos anos, o processamento de fermentação de café tem se concentrado em alterar a composição química do café e desenvolver diferentes perfis sensoriais através da utilização de novas tecnologias como a Fermentação Anaeróbica Autoinduzida (SIAF) pelo metabolismo microbiano (BRAGA et al., 2023; JIMENEZ et al., 2023; PEREIRA et al., 2022). Este método consiste na inoculação de microrganismos (leveduras e bactérias) em biorreatores fechados provocando anaerobioses pela produção gradual de CO2 impulsionada pelo metabolismo microbiano (PEREIRA et al., 2022). Essa tecnologia melhora o desempenho fermentativo de bactérias láticas e leveduras, aumentando a produção de metabólitos e a qualidade sensorial da bebida (CASSIMIRO et al., 2022; DA MOTA et al., 2022). No entanto, durante a fermentação e secagem do café, processos fisiológicos do metabolismo germinativo são desenvolvidos no interior da semente. Através de enzimas chaves 10 como a isocitrato liasse, catalase, esterase, que indicam o metabolismo ativo da semente (NUNES DE FREITAS et al., 2017; SELMAR et al., 2006; TAVEIRA et al., 2015). Este processo germinativo é evidentemente reduzido pela falta de condições adequadas (oxigênio, temperatura, atividade da água, ruptura das membranas celulares entre outras) provocando a dormência na semente, diminuição das reservas de nutrientes, assim como diminuição da viabilidade da semente com um possível impacto na qualidade do café (JIMENEZ et al., 2023; SELMAR; KLEINWÄCHTER; BYTOF, 2015; TAIZ et al., 2017a). Neste metabolismo ativo de germinação das sementes são desenvolvidas alterações na integridade das membranas celulares do embrião, a germinação, teor de ácidos orgânicos e carboidratos, impactando na qualidade do café através da migração de compostos no interior do grão (KLEINWÄCHTER; SELMAR, 2010; SELMAR et al., 2006; TAVEIRA et al., 2015). Na atualidade a fermentação do café utiliza culturas iniciadoras para controlar o processo fermentativo e assim obter cafés com melhorias na composição química e sensorial (DA MOTA et al., 2020; SCHWAN et al., 2022). Nesse contexto as leveduras Saccharomyces cerevisiae (CCMA 0543), Candida parapsilosis (CCMA 0544), e Torulospora delbrueckii (CCMA 0684), foram estudadas como potenciais culturas iniciadoras (EVANGELISTA et al., 2014; MARTINEZ et al., 2019; RIBEIRO et al., 2017). Estas leveduras isoladas e identificadas nos processos de fermentação do café (Coffea arabica L.) foram testadas em diferentes métodos de processamento do café, mostrando a capacidade de produzir enzimas que degradam a mucilagem (atividade pectinolítica), inibem o crescimento de fungos produtores de micotoxinas e produzem componentes ativos de sabor (DA MOTA et al., 2020; DE SOUZA et al., 2017). Desta maneira, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da fermentação do café na viabilidade das sementes, composição química e na qualidade sensorial da bebida utilizando como culturas iniciadoras, as leveduras: Saccharomyces cerevisiae (CCMA 0543), Candida parapsilosis (CCMA 0544), e Torulospora delbrueckii (CCMA 0684), através de fermentação por anaerobioses induzida (SIAF) em Coffea arabica L. variedade Topazio amarelo, por processamento natural e despolpado. 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Generalidade do café O café é uma das bebidas mais populares do mundo, com cerca de quatrocentos bilhões de xícaras sendo consumidas todos os anos (SPENCE; CARVALHO, 2020). É uma cultura 11 comercial de importância econômica primária em países produtores como Brasil, Colômbia, Vietnã, Etiópia e Indonésia (CONAB, 2019). O café é pertencente ao gênero Coffea à família Rubiaceae e compreende 103 – 124 espécies dependendo da amplitude da classificação taxonômica (DAVIS et al., 2011). Entretanto, apenas duas espécies são responsáveis por contabilizar toda a produção global de café; Coffea arabica L., muitas vezes referido como 'Arabica', responsável por aproximadamente o 60% da produção mundial e Coffea canephora Pierre ('Robusta') responsável pelos 40% restantes (CHENG et al., 2016; HALL; TREVISAN; DE VOS, 2022). A espécie do gênero Coffea, variedade C. arabica L., é considerada um café com um perfil sensorial mais apreciado a nível internacional, descrito como aromático, saboroso e agradável ao paladar em comparação com C. canephora Pierre considerado mais amargo e com perfil menos aromático. No entanto, as preferências de gosto (locais, nacionais, culturais) devem ser consideradas, pois diferem consideravelmente (SENINDE; CHAMBERS, 2020). 2.2 Qualidade do café A qualidade do café é um conjunto de caraterísticas sensoriais do grão ou da bebida que caracteriza os sabores e gostos do café, sem excluir os atributos físicos, químicos, sensoriais e higiênico sanitários, que proporcionam prazer e segurança ao consumidor. Além disso, a qualidade do café pode ser considerada como a bebida que apresenta sabor e aromas agradáveis, acidez natural e suavidade ao paladar, assim como efeitos positivos na saúde e no estado de alerta, como origem geográfica e aspectos ambientais e sociais, além das condições de preços, livre de defeitos e de acordo com as normas higiênico sanitárias (BOREM, 2008; HAILE; KANG, 2019). Esta qualidade pode ser influenciada por alguns fatores: físicos (tamanho, cor, uniformidade e grãos com defeito), fatores químicos (componentes-chave como cafeína, trigonelina, sacarose e ácidos clorogênicos, considerados significativos por influenciar a qualidade do café) e fatores sensoriais (sabor, ou seja, a qualidade da xícara) (BORÉM et al., 2019; CHENG et al., 2016; MARQUES et al., 2008). No entanto, todos esses fatores são englobados pelas considerações gerais de genética e melhoramento de plantas, que dependem da constituição genética ou genótipo, das condições ambientais para a qual o genótipo está submetido e a interação entre eles (FIGUEIREDO et al., 2015). Além disso hoje em dia a qualidade de café é medida através da análise sensorial por juízes treinados pelo método de avaliação sensorial da Specialty Coffee Association (SCA), 12 baseado em uma análise descritiva quantitativa da bebida, avaliando os atributos: fragrância, aroma, sabor, retrogosto, acidez, corpo, uniformidade, equilíbrio, doçura, limpeza, defeitos, e pontuação geral, a qual consiste em dar uma pontuação geral de 0-100, classificando aqueles cafés com pontuações acima de 80 como cafés especiais (LINGLE, 2011; SCA, 2018). Os cafés especiais, são cafés da mais alta qualidade produzidos em quantidades limitadas e rastreáveis de uma única origem (terroir). Eles são caracterizados por um sabor e aroma distintos e superiores, o que é resultado das condições específicas de cultivo e colheita (JESZKA, 2022). Desse modo para os consumidos, o sabor é sem dúvida o aspecto mais importante de um bom café (SUNARHARUM; WILLIAMS; SMYTH, 2014). 2.3 Processamento pós-colheita do café Antigamente o principal objetivo do processamento do café era a remoção da camada de mucilagem para facilitar a secagem do grão (BELITZ; GROSCH; SCHIEBERLE, 2009). Na atualidade o processamento pós-colheita visa a remoção da polpa dos frutos maduros, sendo um passo fundamental para a obtenção de alta qualidade no produto (CORTÉS-MACÍAS et al., 2022; HAMEED; HUSSAIN; SULERIA, 2020). Assim, os frutos do café são transformados em grãos de café beneficiados com porcentagens de umidade em torno de 11% a 12% a partir da retirada das partes que envolvem os grãos (HAMEED; HUSSAIN; SULERIA, 2020). Além disso, deve-se evitar fermentações indesejáveis e deterioração dos frutos que possam influenciar negativamente a qualidade sensorial do café (BARRIOS-RODRÍGUEZ et al., 2021). Assim o processamento de café é possível através de três tipos de métodos: seco, semisseco e úmido (BRANDO & BRANDO, 2015) (Figura 1). a) Método cereja natural: a fruta inteira recém-colhida é fermentada e seca em plataformas, após as quais os grãos de café são removidos por beneficiamento (removida a camada de casca que cobre os grãos de café secos) (SILVA et al., 2000). b) Método cereja descascado: a casca de café, a polpa e parte ou toda a mucilagem são removidas mecanicamente e, em seguida, o café é fermentado e seco (BRANDO; BRANDO, 2015). É considerado um processamento intermediário entre o processamento seco e o úmido e que consome mais água do que o processamento natural direto. A cereja do café é então seca ao sol, com grande parte da mucilagem ainda presa, em uma cama de secagem elevada ou em um pátio (SILVA, 2015). c) Método úmido: a casca e a polpa são removidas mecanicamente, deixando a 13 silagem aderida ao fruto. Esses cafés despolpados são então transferidos para tanques de água, onde são permitidos fermentar por 6 a 72 h (dependendo da temperatura ambiente), durante os quais a mucilagem restante é degradada e solubilizada. Em seguida, os grãos são removidos dos tanques e secos ao sol (SILVA, 2015). Do mesmo modo o método úmido, é um processo de pós-colheita usado para manter a suavidade do café arábica, envolve a remoção mecânica da casca da fruta (exocarpo ou polpa) para expor a camada de geleia (mesocarpo ou mucilagem) aderida à superfície do grão. No processo de degradação da mucilagem, os microrganismos no ambiente utilizam a mucilagem como substrato para seus processos metabólicos, gerando ácidos orgânicos, entre outros (PEÑUELA-MARTÍNEZ; ZAPATA-ZAPATA; DURANGO- RESTREPO, 2018; SUNARHARUM; WILLIAMS; SMYTH, 2014). Durante este processamento pós-colheita surgem mudanças na composição química dos grãos de café verde podendo ser atribuídas aos processos metabólicos, que são específicos para cada tipo de tratamento pós-colheita (BRESSANI et al., 2021; SELMAR et al., 2006). Provavelmente pela variação de fatores como a remoção de algumas partes que constituem o fruto (casca, mucilagem), que contêm nutrientes (açúcares, aminoácidos, proteínas) assim como hormônios e enzimas presentes que favorecem a germinação do embrião (MUNYENDO et al., 2021; RIBEIRO et al., 2017). Além disso, em todos esses métodos de processamento, é realizada uma fermentação espontânea por microrganismos epifíticos do café que elimina qualquer mucilagem ainda aderida no fruto que ajuda a melhorar o sabor da bebida pelos metabólitos microbianos (SCHWAN et al., 2022; SILVA, 2015; WANG; WU; SHYU, 2014). Figura 1 Métodos de processamento pós-colheita de café. Fonte: Adaptado de BRANDO & BRANDO (2015). 14 Esta fermentação ocorre através de diferentes interações dos microrganismos; (i) microrganismos e substrato; (ii) microrganismos e metabólitos; e (iii) diferentes grupos microbiológicos em nível de espécie e cepa, induzindo alterações bioquímicas e/ou físicas no substrato que também influenciam a fermentação (NIELSEN; ARNEBORG; JESPERSEN, 2015). Além do desenvolvimento de processos catabólicos de oxidação de substâncias orgânicas, principalmente açúcares que são transformados em energia e em compostos mais simples, como etanol, ácido lático, ácido acético e ácido butírico (PUERTA QUINTERO; MEJÍA; OSORIO BETANCOUR, 2012). Assim é possível que esses metabolitos microbianos produzidos durante a fermentação, como as enzimas presentes migram ao interior do grão provocando mudanças na composição química e sensorial do café (HADJ SALEM et al., 2020; HAILE; KANG, 2019; PEREIRA et al., 2022; WANG et al., 2020). 2.3.1 Influência do método de processamento O processamento natural ou seco é a forma mais antiga, barata e fácil de transformar os frutos maduros de café em grãos de café beneficiados. Onde os frutos de café são secos ao sol (fermentação), produzindo um café com forte aroma, acidez moderada, corpo intenso e agradável (HAMEED; HUSSAIN; SULERIA, 2020; SCHOLZ et al., 2019). O processamento natural é a maneira mais difícil de proteger e manter a alta qualidade do café, pois os frutos inteiros são secos ao sol ou à máquina sob luz solar direta em superfícies planas, canteiros elevados (terra nua, piso cimentado ou tijolo, mesas com tela de arame, esteiras de bambu, asfalto ou superfícies de madeira) ou em máquinas de secagem junto com as camadas externas intactas do fruto fornecendo uma bebida com corpo pesado e atributos doces, suaves e complexos (HAMEED; HUSSAIN; SULERIA, 2020; SANZ-URIBE et al., 2017). Também há um maior número de grãos defeituosos com defeitos de café terroso, mofado e esverdeado que são encontrados no café processado a seco (TADESSE; JEMAL; ABEBE, 2015). Pesquisas comparando tratamentos usando os mesmos materiais iniciais e realizadas especificamente para testar os diferentes métodos de processamento demonstraram que o próprio método de processamento afeta a química do grão e a qualidade subsequente (HALL; TREVISAN; DE VOS, 2022). Por exemplo, os grãos obtidos pelo método de processamento a seco superaram os do método de processamento por via úmida em certas características bioquímicas, podendo ser correlacionadas com a qualidade. Grãos processados por via seca apresentam níveis mais altos de sacarose, teores mais baixos de trigonelina e 3-CQA em comparação com grãos processados por via úmida (DIEGO et al., 2016; TOLESSA et al., 15 2019). De igual forma Scholz et al. (2019) compararam a composição química de cafés processados pelos processamentos descascados e naturais, observando maiores teores de lipídios, cafeína, compostos fenólicos, ácidos clorogênicos e acidez nos cafés processados pelo método natural em comparação com o processamento descascado. Desta forma observaram a influência do método de processamento na composição química do café, a qual pode ser influenciada pelo método de processamento elegido. Finalmente (HAMEED; HUSSAIN; SULERIA, 2020), apresentam vantagens e desvantagens dos processamentos seco, semisseco e úmido na Tabela 1. Tabela 1 Vantagens e desvantagens dos métodos de processamento do café. Métodos de processamento Vantagens Desvantagens Seco Processo simples Processo demorado (3-4 semanas) Baixo custo Sobre fermentação Fácil de executar e manusear Contaminação por fungos/mofo Menos trabalhoso Produção de ocratoxina A Maior taxa de secagem Maior taxa de grãos defeituosos Cerejas maduras e imaturas podem ser usadas Menos mercado de exportação devido às chances de matéria estranha Nível mais alto de proteínas (de armazenamento) e hexoses (glicose e frutose) em infusão Atributos de qualidade menos desejáveis (corpo pesado com doçura e atributos complexos) Amigo do ambiente Úmido Economia de tempo Caro Fermentação controlada Trabalhoso Aumentar o conteúdo de estaquiose e sorbitol Precisa de arranjos adicionais Maior teor de CGA e trigonelina Cerejas maduras são necessárias Maior produção de ácido orgânico Mercado de exportação atraente Menos amigo do ambiente Menor taxa de grãos defeituosos Menos chances de produção de OTA Semi seco Transição do sistema seco e semiúmido Caro Cerejas pouco maduras, maduras podem se usar Menos praticado globalmente Maior teor de cafeína Trabalhoso Nível intermediário de CGA Menos amigo do ambiente Conteúdo de trigonelina mais baixo Sabor mais limpo com menos acidez e corpo Fonte: (HAMEED; HUSSAIN; SULERIA, 2020). 16 2.4 Anatomia e composição química do café Segundo Borém (2008) o conhecimento da anatomia e da composição química do fruto e da semente do cafeeiro é fundamental para a adequada compreensão dos fenômenos fisiológicos, físicos e químicos que ocorrem durante a pós-colheita do café. Esta composição química do café verde e a qualidade final do café podem ser alteradas pelo tipo de tratamento pós-colheita (ELHALIS; COX; ZHAO, 2023; SANZ-URIBE et al., 2017). Desta forma cabe mencionar que o fruto de café é constituído por seis partes: o exocarpo (casca), mesocarpo (mucilagem), endocarpo (pergaminho), e a semente composta pelo perisperma (película prateada), endosperma e embrião (Figura 2) (BOREM, 2008; FERREIRA et al., 2019). Figura 2 Morfologia da semente de café. A. Corte transversal de um fruto de café. B. Embrião de C. arabica L., (esquerda) isolado e (direita) com a superfície externa do endosperma cortada para expor o embrião. C. Perisperma (película prateada). Fonte: (FERREIRA et al., 2019). Além disso, é importante mencionar que a camada mucilaginosa dos grãos de café está composta por 84,2% de água, 8,9% de proteína, 4,1% de açúcar, 0,91% de substâncias pécticas e 0,7% de cinza (BELITZ; GROSCH; SCHIEBERLE, 2009). Também é fornecida uma análise das diferenças na composição química entre o café arábica e o café robusta é fornecida na Tabela 2. Tabela 2 Composição química do café verde (variedades arábica e robusta) *a, b. (Continua). Componentes Arábica Robusta Constituinte Carboidratos solúveis 9-12.5 6-11.5 Monossacarídeos 0.2-0.5 Frutose, glicose, galactose, arabinose, (traços). Oligossacarídeos 6-9 3-7 Sacarose (> 90%), rafinose (0-0,9%), estaquiose (0-0,13%). 17 Tabela 2 Composição química do café verde (variedades arábica e robusta) *a, b. (Conclusão). *a Valores em % de sólidos *b Teor de água do café cru: 7-13% *c Componentes principais: ácido 5- cafeoilquínico (ácido clorogênico: Arábica 3,0–5,6%; Robusta 4,4–6,6%). Fonte: (BELITZ; GROSCH; SCHIEBERLE, 2009) 2.5 Influência do processamento na química do café A composição química dos grãos de café verde é muito complexa, incluindo mais de 1.000 substâncias com diferentes propriedades químicas e físicas, estas sustâncias são divididas em dois grupos de compostos, sendo eles os voláteis e não voláteis (DE PEÑA; LUDWIG; CID, 2019). Os principais precursores de aroma são carboidratos insolúveis (celulose e hemicelulose), carboidratos solúveis (arabinose, frutose, galactose, glicose, sacarose, rafinose) (FADAI et al., 2017; POISSON et al., 2018; WANG et al., 2020), ácidos orgânicos (cítrico, málico, oxálico, tartárico, pirúvico, quínico, clorogênico, acético e outros), lipídios formados por ácidos graxos (tocoferóis, esteróis, ésteres de ácidos graxos, diterpenos e outros), aminoácidos, proteínas voláteis (DE PEÑA; LUDWIG; CID, 2019), e compostos voláteis como: hidrocarbonetos, álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos, ésteres, pirazinas, Componentes Arábica Robusta Constituinte Polissacarídeos 3-4 Polímeros de galactose (55-65%), manose (10- 20%), arabinose (20-35%), glicose (0-2%). Polissacarídeos insolúveis 46-53 34-44 Hemiceluloses 5-10 3-4 Polímeros de galactose (65-75%), arabinose (25- 30%). manose (0-10%). Celulose β(I-4) mannan 41-43 32-40 Ácidos e fenóis Ácidos voláteis 0.1 Ácidos alifáticos não voláteis 2-2.9 1.3-2.2 Ácido cítrico, ácido málico, ácido quínico Ácido clorogênico 6.7-9.2 7.1-12.1 Ácido mono-, dicafeoil- e feroililquinico Lignina 1-3 Lipídios 15-18 8-12 Cera 0.2-0.3 Óleo 7.7-17.7 Principais ácidos graxos: 16: 0 e 18: 2 (9,12). Compostos N 11-15 Aminoácidos livres 0.2-0.8 Principais aminoácidos: Glu. Asp. Asp-NH2. Proteínas 8.5-12 Cafeína 0.8-1.4 1.7-4.0 Traços de teobromina e teofilina. Trigonelina 0.6-1.2 0.3-0.9 Minerais 3-5.4 18 pirroles, piridinas, outras bases, compostos enxofres, furanos, fenóis, oxazoles e outros (DE PEÑA; LUDWIG; CID, 2019; FLAMET, 2002). No entanto, durante o processamento de pós-colheita (fermentação) são geradas alterações físico-químicas nos grãos (alterações nos compostos voláteis e não voláteis), gerando sabores e aromas adicionais através dos metabólitos produzidos neste devido processo (EVANGELISTA et al., 2014; JOËT et al., 2010; KNOPP; BYTOF; SELMAR, 2006; SILVA et al., 2013). Esses metabólitos estão relacionados à produção microbiana de metabólitos finais, incluindo ésteres, ácidos orgânicos, aldeídos e álcoois superiores, que se difundem nos grãos e fornecem atributos sensoriais únicos (ELHALIS et al., 2020; ELHALIS; COX; ZHAO, 2020; FELDMANN, 2012). 2.5.1 Compostos voláteis e não voláteis no café A avaliação dos compostos voláteis e não voláteis do café afeta diretamente sua qualidade sensorial, sendo de extrema importância para definir a qualidade final do produto. A presença desses compostos bem como sua concentração são influenciados pelos microrganismos (leveduras e bactérias láticas principalmente) presente durante o processo fermentativo. Diferentes ácidos orgânicos já foram detectados como lático, cítrico, málico, succínico, acético e tartárico. Esses ácidos contribuem para a acidez da bebida, sendo um atributo importante para a qualidade do café em combinação com a doçura, amargor e aroma. Entretanto, ácidos indesejados como butírico e propiônico conferem à bebida sabores estranhos como cebola e a sua presença mostra que os grãos foram fermentados excessivamente (BRESSANI et al., 2020; SUNARHARUM; WILLIAMS; SMYTH, 2014). Martinez et al. (2019) avaliaram o efeito de culturas iniciadoras bacterianas e de leveduras na formação de ácidos orgânicos durante a fermentação úmida de cafés arábica, identificando oito ácidos orgânicos. O controle não apresentou ácido málico, succínico, lático e acético. Os ácidos málico, lático e acético só foram detectados em tratamentos com bactérias e estes podem estar relacionados à sua atividade metabólica. Já o ácido succínico foi detectado em todos as culturas bacterianas e em duas leveduras, Candida parapsilosis CCMA 0544 e Torulaspora delbrueckii CCMA 0684. O ácido succínico é um dos principais ácidos orgânicos produzido por leveduras e é formado no ciclo do glioxilato por oxidação do isocitrato, bem como no ciclo redutor do ácido cítrico. 2.6 Leveduras e seu comportamento durante a fermentação do café 19 As leveduras, possuem grande influência através da geração de diferentes compostos que influenciam o aroma por meio do metabolismo de carbono e nitrogênio. Além disso, cepas de leveduras isoladas do café são capazes de promover a degradação da pectina por meio da produção de diferentes enzimas hidrolíticas como poligalacturonase, pectina liase e pectina metilesterase. A hidrólise da pectina libera açúcar simples como fonte de carbono adicional para o metabolismo da levedura e formação de aroma (SILVA et al., 2013). Etanol, acetaldeído e ácido acético são os metabólitos primários produzidos pela levedura durante a fermentação do café. Entretanto, junto com etanol, muitos compostos de sabor de baixo peso molecular são produzidos durante o processo de remoção da mucilagem, como ésteres, álcoois superiores, aldeídos, cetonas e terpenos (DEAK, 2008; FELDMANN, 2012; PRETORIUS, 2000). Dependendo do tipo de levedura e das condições ambientais (presença ou ausência de oxigênio, temperatura, aw, pH), o crescimento de leveduras pode ser favorecido ou limitado permitindo o crescimento ou inibição de outros microrganismos presentes no café (bactérias ácido-láticas, mesófilos e fungos) provocando diferentes vias metabólicas (Figura 3) neste processo (EVANGELISTA et al., 2015; MARTINS et al., 2019; PEREIRA et al., 2022). Além disso, são observadas interações de microrganismos, com as leveduras que ajudam a criar as condições ideais para seu crescimento (como a redução do pH e aw) (DEAK, 2008; FELDMANN, 2012; PRETORIUS, 2000). Figura 3 Potenciais compostos de aroma que podem ser gerados pelas leveduras durante a fermentação do café a partir dos precursores presente no fruto. Fonte: Adaptado de (DEAK, 2008; FELDMANN, 2012; PRETORIUS, 2000). 20 2.7 Fermentação Anaeróbica Autoinduzida (SIAF) Cassimiro et al. (2023) definem a fermentação anaeróbica autoinduzida (SIAF) como um método de fermentação em que a condição anaeróbia é gradualmente formada pelo metabolismo microbiano que utiliza o O2 restante para suas reações metabólicas, liberando CO2, compostos voláteis e não voláteis. Este método tem sido considerado para substituir ou complementar as comunidades microbianas naturais tradicionalmente utilizadas (epifíticas), com o objetivo específico de direcionar o processo de fermentação de forma deliberada, torná- lo mais uniforme e o resultado mais previsível, a fim de produzir grãos de café com melhor qualidade sensorial (BRESSANI et al., 2021; HAILE; KANG, 2019; WANG et al., 2020). Além disso, o método SIAF impacta positivamente o desempenho fermentativo de LAB e leveduras durante o processamento de café (DA MOTA et al., 2020; JIMENEZ et al., 2023; PEREIRA et al., 2022). Figura 4 Processamento do café natural com diferentes formas de inoculação. A) inoculação direta da levedura no fruto e levada para terreiro suspenso; B) inoculação da levedura em biorreator (SIAF), fermentado e após 16 - 72 horas, o café é levado para um terreiro suspenso. Fonte: Do autor (2023). 2.8 Uso de Cultivos Iniciadores 21 Os microrganismos responsáveis pela fermentação do café (leveduras e bactérias do ácido lático) podem desempenhar uma série de papéis, como degradação da mucilagem (atividade pectinolíticas), inibição do crescimento de fungos produtores de micotoxinas e produção de componentes ativos de sabor (DA MOTA et al., 2020; DE SOUZA et al., 2017). Além disso o uso de culturas iniciadoras (principalmente linhagens de leveduras), surgiu nos últimos anos como uma alternativa promissora para controlar o processo de fermentação e promover o desenvolvimento da qualidade do café, fornecendo maior controle e consistência modificando os precursores de sabor e perfis de voláteis com caraterísticas desejáveis (EVANGELISTA et al., 2014; LEE et al., 2017; SILVA et al., 2013). As fermentações controladas em cafés são utilizadas a fim de obter maior qualidade e evitar o crescimento de microrganismos indesejáveis como Aspergillus spp (produtor de ocratoxina A) (POLTRONIERI; ROSSI, 2016). A adição de starters no processo fermentativo pode apresentar comportamentos diferentes dependendo de diferentes fatores como o tipo de café, o estado de maturação, o método de processamento, condições ambientais como temperatura, metros de altitude, resultando em cafés com caraterísticas sensoriais diferentes e positiva comparados com cafés sem utilização de starters (BRESSANI et al., 2018; EVANGELISTA et al., 2014; MARTINS et al., 2019; RIBEIRO et al., 2017). Apesar dos benefícios da fermentação do café, esse processo deve ser monitorado uma vez que, quando mal executada, a fermentação pode resultar em sabores indesejáveis (azedo) (POLTRONIERI; ROSSI, 2016). O monitoramento do processo fermentativo (temperatura, pH, sólidos solúveis) ajuda a conhecer o desenvolvimento do processo, já que o aumento da temperatura é um indicador do aumento da população microbiana, e a diminuição do pH junto com a estabilidade da temperatura são indicadores do final do processo (DA MOTA et al., 2020; JIMENEZ et al., 2023; MARTINS et al., 2020). 2.9 Respostas metabólicas dos grãos de café durante o processamento Durante o processamento pós-colheita do café são desenvolvidas alterações bioquímicas importantes nos grãos de café, relacionadas ao metabolismo da germinação, cuja extensão depende do método de processamento, seja úmido ou seco (SELMAR; KLEINWÄCHTER; BYTOF, 2015; TAVEIRA et al., 2015). Taiz et al. (2017a) descrevem como as sementes iniciam um processo de dormência que pode ser provocado por conta de inibidores internos (ácido abscísico - ABA) que impedem o desenvolvimento do processo germinativo, denominado dormência primária. O ABA é um 22 inibidor natural da germinação no fruto do café, que dependendo do tipo de processo pós- colheita, ele pode ser eliminado de forma mecânica, o que facilita o início do processo germinativo dependendo do método de processamento (SELMAR et al., 2006). Além do ABA as condições não favoráveis que inibem a germinação por um período conhecido como dormência secundária, é aquela dormência fisiológica imposta ao embrião pela casca da semente e por outros tecidos envolventes, como endosperma, pericarpo ou órgãos extraflorais, é conhecida como dormência imposta pela casca, a qual tem uma limitação mecânica da dormência (TAIZ et al., 2017a). Além disso, para que os processos metabólicos das sementes possam iniciar são necessárias diferentes condições ambientais (aw, temperatura, oxigênio) assim como condições físicas que eliminem os hormônios presentes naturalmente no café que inibem estes processos (ABA), no entanto o processamento pós colheita (seco ou úmido) rompem a casca e eliminam alguns desses inibidor facilitando o início dos processos metabólicos da germinação (FERREIRA et al., 2018; SELMAR et al., 2006; TAIZ et al., 2017b). 2.9.1 Atividade enzimática durante a pós-colheita do café Existem diferentes enzimas envolvidas na proteção e manutenção do embrião e das camadas protetoras (membranas) das reservas energéticas (esterase, catalase, peroxidase entre outras) (SANTOS et al., 2021), assim como enzimas chaves necessárias para o início do metabolismo germinativo (entre estas: isocitrato liase, beta tubulina, endo beta mananase) (SELMAR et al., 2006; TAIZ et al., 2017c). Durante os processos fermentativos dependendo do método de processamento (natural, CD ou úmido) alterações mecânicas (retirada da casca), assim como dano nas membranas celulares, aceleram a perda de hormônios naturais inibidores da germinação (ABA e a permeabilidade da casca), que junto com condições ambientais (aw, temperatura, oxigênio) permitem o início de processos metabólicos germinativos assim como consumo de reservas energéticas, oxidação, morte do embrião (COELHO et al., 2015; JIMENEZ et al., 2023; SELMAR; KLEINWÄCHTER; BYTOF, 2015; TAVEIRA et al., 2015). A presença de algumas enzimas catalase, oxidase, peroxidase, mostram a atividade de manutenção, início de processos oxidativos, assim como reação a ambientes estressantes (anaerobioses no caso do álcool desidrogenase) que podem resultar em perda de reservas energéticas pelas rotas metabólicas desenvolvidas nos processos metabólicos de respiração e manutenção da semente, assim como dano ou morte do embrião (ŠVUBOVÁ et al., 2021; TAIZ et al., 2017a). 23 3 CONSIDERAÇÕES GERAIS O processamento pós-colheita é uma das etapas essenciais na produção de café e, juntamente com uma boa seleção de genética, manejo e processamento, nos ajuda a produzir cafés com boa qualidade química e sensorial. Na atualidade a utilização de diferentes métodos de processamento (natural, despolpado e úmido) junto com a utilização de novas tecnologias no processo de fermentação (SIAF, com ou sem inoculação de microrganismos) assim como o monitoramento constante dos processos, pode permitir um processamento padronizado, assegurando boa qualidade do café. Os metabolismos germinativos da semente do café são desenvolvidos durante o processo de fermentação do café, e estes podem provocar câmbios nas reservas energéticas no interior da semente, além disso a fermentação do café por SIAF provoca uma diminuição na viabilidade e morte da semente. No entanto esta diminuição da viabilidade da semente produzida durante a fermentação não é diretamente relacionada com uma diminuição da qualidade do café. Já que durante este processamento existe difusão de compostos orgânicos ao interior da semente (açúcares, compostos voláteis, álcoois, aminoácidos entre outros) potencializando a qualidade sensorial do café. 24 REFERÊNCIAS ABREU, G. F. DE et al. Simultaneous optimization of coffee quality variables during storage. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, v. 21, n. 1, p. 56–60, 2017. Disponível em: http://dx.doi.org/10.1590/1807-1929/agriambi.v21n1p56-60. Acesso em: 20 jun. 2021. BARRIOS-RODRÍGUEZ, Y. F. et al. Infrared spectroscopy coupled with chemometrics in coffee post-harvest processes as complement to the sensory analysis. LWT, v. 145, 1 jun. 2021. Disponível em: https://doi.org/10.1016/j.lwt.2021.111304. Acesso em: 16 maio 2022. BELITZ, H.-D.; GROSCH, W.; SCHIEBERLE, P. Coffee, Tea, Cocoa. Em: Food Chemistry. 4. ed. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2009. p. 938–970. Disponível em: https://doi.org/10.1007/978-3-540-69934-7_22. Acesso em: 17 maio 2022. 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Acesso em: 29 abril 2022. 32 SEGUNDA PARTE: ARTIGOS ARTIGO 1: Influence of anaerobic fermentation and yeast inoculation on the viability, chemical composition, and quality of coffee *Artigo publicado na revista Food Bioscience DOI: https://doi.org/10.1016/j.fbio.2022.102218 Emerson Josue Martinez Jimeneza,e, Pâmela Mynsen Machado Martinsa, Ana Luiza de Oliveira Vilelab, Nádia Nara Batistac, Sttela Dellyzete Veiga Franco da Rosad, Disney Ribeiro Diasa, Rosane Freitas Schwanc* 1Department of Food Science, Federal University of Lavras, Lavras, MG, Brazil. 2Department of Agriculture, Federal University of Lavras, Lavras, MG, Brazil. 3Department of Biology, Federal University of Lavras, Lavras, MG, Brazil. 4Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Embrapa Café, Brasília, DF, Brazil. 5 Faculty of Technological Sciences, National University of Agriculture, the road to Dulce Nombre de Culmí, km 215, neighborhood El Espino, Catacamas, Honduras. * Corresponding Author: Federal University of Lavras, Department of Biology Campus Universitário, 3037 37203-202, Lavras, MG, Brazil. E-mail: rschwan@ufla.br https://doi.org/10.1016/j.fbio.2022.102218 33 Abstract Microbial metabolites produced during fermentation migrate into the coffee and can influence the decrease in seed viability and coffee quality. This study evaluated the effects of physiological changes in seed viability on the sensory quality of the beverage using starter cultures through self-induced anaerobic fermentation (SIAF) in Coffea arabica L. for natural and pulped coffee. The yeasts were monitored by real-time polymerase chain reaction (qPCR). High-performance liquid chromatography (HPLC) detected citric, malic, and succinic acids in all fermented coffees. Furthermore, lactic acid was mainly identified in those coffees processed by the SIAF method. Volatile compounds (40) were detected by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Alterations in physiological quality were identified, with decreased embryonic viability and cell membrane damage by tetrazolium and electrical conductivity tests. All fermented coffees obtained scores above 80 points. The Torulospora delbrueckii yeast got the best score (86.50) in pulped coffee, and the Candida parapsilosis yeast received the highest score (85.90) in the natural coffee using the SIAF method. The coffees were characterized by aromas and flavors of citrus, caramel, honey, chocolate, and chestnut. The coffee fermentation process with yeast inoculation affected the coffee bean viability but not the beverage's sensory quality, indicating that the use of yeast starters by SIAF favors the production of specialty coffees with differentiated sensory characteristics. Keywords: Coffee fermentation, Specialty coffees, Seed physiological, Yeast starter, Sensory quality. 1. Introduction 34 Specialty coffees have changed international trade in recent years, from selling regular coffee to a special product (Sittipod et al., 2019), causing an increase in their popularity in global markets and driving the search for new postharvest technologies that help the production of specialty coffees (Córdoba et al., 2021). Traditionally, postharvest processing of coffee is carried out using natural, pulped, and wet methods, which are considered responsible for some differences observed in the sensory quality of coffee (Nadaleti et al., 2022; Selmar et al., 2014). During postharvest processing, fermentation occurs spontaneously by epiphytic microorganisms (bacteria, yeasts, and fungi), which process the coffee mucilage (Silva et al., 2013). The production of microbial metabolites can reach the interior of the seed, thus leading to beneficial (organic acids of interest, esters, alcohols, sugars) or harmful effects (undesirable organic acids and toxins) on the quality of coffee beans (Elhalis et al., 2021; Hadj Salem et al., 2020; Wang et al., 2019; 2022). In addition, during the postharvest period, physiological processes associated with germination begin inside the seed (respiration and cell division). As a result, they can use energy reserves, putting the embryo's viability at risk and causing the risk of a negative impact on the sensory quality of the coffee beverage (da Silva et al., 2019; Kitzberger et al., 2020; Selmar et al., 2006, 2014). When the coffee fruit reaches maturity, the seed is ready to begin germinating. However, this metabolic process is inhibited by a dormancy process caused by natural inhibitors (abscisic acid), the shell (a protective barrier that creates an impenetrable environment), and the lack of environmental conditions (moisture, oxygen, light, and temperature) (Taiz et al., 2017). During the postharvest period, the start of the metabolic processes of germination may be linked to the appropriate conditions and the elimination of natural inhibitors present in coffee (Selmar et al., 2006; Taiz et al., 2017). The use of starter cultures (mainly yeast strains) has emerged as a promising option to improve the quality and modify the sensory profile of coffee (Cassimiro et al., 2022; Elhalis et 35 al., 2021; Mahingsapun et al., 2022). These microbial starters may be used in closed bioreactors, thus creating an anaerobic environment that allows for self-induced anaerobic fermentation (SIAF) (da Mota et al., 2022; Pereira et al., 2022). The SIAF method consists of gradual CO2 production driven by microbial metabolism, improving the fermentative performance of lactic acid bacteria (LAB) and yeasts and increasing the production of metabolites (organic acids, alcohols, and volatile composts) that intensify the aromas and flavors desired in coffee (Cassimiro et al., 2022; Martinez et al., 2019). Consequently, the present study aimed to evaluate the effects of decreased seed viability on the sensory quality of the coffee beverage for natural and pulped postharvest coffee (Coffea arabica L. variety Topázio Amarelo) processed using starters (Saccharomyces cerevisiae CCMA0543, Candida parapsilosis CCMA0544, and Torulospora delbrueckii CCMA0684) by SIAF compared with that of coffee processed by a SIAF control and a conventional process (without bioreactors) through physiological, real-time polymerase chain reaction (qPCR), chemical and sensory analysis. 2. Materials and Methods 2.1. Coffee Coffee cherries (Coffea arabica L.) of the 'Topazio Amarelo' variety were harvested at an altitude of 850 meters above sea level at the farm Cafés Monte Alegre (S 1°59'56", W 54°4'58") in Alfenas, Minas Gerais (M.G.), Brazil. 2.2. Yeast The Saccharomyces cerevisiae (CCMA0543), Candida parapsilosis (CCMA0544), and Torulaspora delbrueckii (CCMA0684) yeasts belonging to the Agricultural Microbiology Culture Collection (CCMA) of the Department of Biology at UFLA, Lavras, M.G., Brazil, were 36 selected as starter cultures for their ability to survive throughout the fermentation process and for generating chemical and sensory changes that improve coffee quality (Silva et al., 2013). The yeasts stored at -80°C were reactivated and grown according to Martins et al. (2022). Cells were recovered by centrifugation (3200 × g; 10 min) and resuspended in sterile water (500 mL) until reaching a concentration of 107 and 108 cells/mL in coffee. 2.3. Coffee fermentation processing The natural and pulped coffee (40 L) was processed without and with yeast inoculation in high-density polyethylene cylindrical bioreactors with a 50 L capacity using the method of SIAF (da Mota et al., 2022; Pereira et al., 2022). Five treatments were performed: conventional processing (the traditional process where the coffee is harvested and then dried in the sun on cement platforms, with the addition of pulping for pulped coffee), SIAF control (without inoculation), S. cerevisiae (CCMA0543), T. delbrueckii (CCMA0684), and C. parapsilosis (CCMA0544). All the treatments were carried out in triplicate. During fermentation, the temperature and humidity of the environment and the temperature and concentration of coffee solids (% TSS) were monitored until stabilized (Table 1) (da Mota et al., 2022; Pereira et al., 2022). The fermentation time for both natural and pulped coffee was 180 h, and the end of fermentation occurred by decreasing the coffee temperature (Table 1). Samples were taken at the beginning of fermentation (0 h) and at the end of drying (480 h). The coffee was dried immediately in the sun on suspended terraces until reaching 11% moisture. 2.4. Monitoring of inoculated yeast populations The inoculated yeast population was monitored by qPCR using a QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden Germany) to extract DNA from sample strains at the end of processing (480 h). All yeast species were cultured separately on YEPG agar at 28°C for 24 h. They were serially 37 diluted (1:10) from 108 to 103 cells/mL, measuring each point of the standard curve in triplicate for use in qPCR (Batista et al., 2015). For this analysis, it was necessary to use specific primers (Supplementary Table S.1) for each yeast species. 2.5. Analysis of chemical compounds 2.5.1. Determination of organic acids by high-performance liquid chromatography (HPLC) Organic acids (acetic, citric, lactic, malic, oxalic, succinic, and tartaric) were evaluated by HPLC (Shimadzu Corp., Japan) with a UV detector at 210 nm. The natural and pulped coffee was evaluated at the beginning and end of fermentation (0 and 480 h). The operating conditions were described by Evangelista et al. (2014). For each sample, ten grams of coffee was mixed twice with 10 mL of Milli-Q water for 5 minutes, and the solutions (20 mL) were centrifuged at 12,745 × g for 10 minutes at 4°C. The pH value of the samples was adjusted to 2.11 with perchloric acid and centrifuged again. Then, the supernatant was filtered through 0.22 μm cellulose acetate membranes. The samples obtained were stored at -18°C until analysis. 2.5.2. Analysis of volatile compounds by headspace/solid-phase (HS-SPME) microextraction/gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) Volatile compounds were extracted from roasted coffee and green coffee at the end of postharvest processing using a manual headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) procedure and a 50/30 μm divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane SPME fiber (Supelco Co., Bellefonte, PA., USA) (Evangelista et al., 2014). Two grams of coffee from each treatment were ground with liquid nitrogen and placed in a 15 mL hermetically sealed flask. After equilibration at 60°C for 15 min, the volatile compounds were extracted at 60°C for 30 min. Injections were performed by fiber exposition for 2 min. A GCMS-QP2010 (Shimadzu) equipped with mass spectrometry (MS) and a silica capillary Carbo-Wax 20 M (30 m×0.25 mm 38 x 0.25 mm) column were used for GC/MS analysis. The oven temperature was held at 60°C for 5 min, followed by a gradient from 60°C to 230°C at 10°C/min, and held at 230°C for 15 min. The carrier gas (He) was used at a flow rate of 1.95 mL/min. The volatile compounds were identified by comparing the mass spectra to the NIST11 library. In addition, an alkane series (C10–C40) was used to calculate each compound's retention index (RI) and compare them to the scholarly literature's RI values. 2.6. Tetrazolium test Fifty seeds from each fermentation protocol with four replicates were soaked in water (36 h). The embryos were then extracted and kept in a polyvinylpyrrolidone (PVP) antioxidant solution until submerged in a 0.5% 2, 3, 5 triphenyl chloride tetrazolium solution in dark flasks at 30°C for 2 h. Finally, a longitudinal cut was made in the middle of the embryos to perform the viability analysis of the embryo with a 10x stereoscopic magnifying glass to visualize its internal and external structures, better classifying them as viable and nonviable according to the location and extension of the stained areas (Clemente et al., 2012). 2.7. Electrical conductivity (E.C.) Four replicates of 25 seeds of each fermentation treatment were first weighed and then soaked in containers with 37.5 mL of deionized water, keeping them in BOD at a constant temperature of 25°C for 24 h. After that period, the electrical conductivity of the solution containing the seeds was read in μS.cm-1. g-1 (Malta et al., 2005). 2.8. Sensory evaluation Five trained coffee tasters with Q-Grader certificates evaluated the coffee samples, following the sample preparation protocol of the Specialty Coffee Association. The following 39 attributes were evaluated: fragrance, aroma, flavor, aftertaste, acidity, body, uniformity, balance, sweetness, cleanliness, defects, and general score according to the SCA Cupping Protocol (SCA, 2018, p. 14). 2.9. Statistics The treatments were applied through a 5x2 mixed factorial design (yeast x processing method) to evaluate sensory analysis, organic acids, electrical conductivity, and tetrazolium test. The tests for organic acids, electrical conductivity, and tetrazolium were also compared before (0 h) and after the fermentation process (480 h) using Student's t test. A 3x2 mixed factorial design (yeast x processing method) was used for qPCR analysis at the end of processing (480 h) to monitor the inoculated yeast population. An analysis of variance (ANOVA) was performed using the Scott Knott test with a 5% significance level (p ≤ 0.05) and with a significance level of p ≤ 0.088 for the tetrazolium test, using the Sisvar software version 5.6 (Ferreira, 2014). In addition, a principal component analysis (PCA) was performed for the volatile compounds using the SensoMaker program v. 1.92 (UFLA, Lavras, Brazil) (Pinheiro et al., 2013). 3. Results 3.1. Population of yeasts by qPCR The population of S. cerevisiae, C. parapsilosis, and T. delbrueckii yeasts at the end of processing was evaluated by qPCR (Figure 1). The inoculated yeasts grew and maintained viability during fermentation. The growth of the C. parapsilosis population was not stimulated by using the SIAF method, and it was minimally present in the conventional process. In inoculated fermentation using SIAF, a higher population of T. delbrueckii (8.10 log10 cells/g) was observed in the natural coffee, while S. cerevisiae (8.21 log10 cells/g) showed the highest 40 population in pulped coffee. The inoculated fermentation with T. delbrueckii reached 8.10 log10 cells/g, followed by S. cerevisiae with 7.71 log10 cells/g for the natural coffee method. In the pulped method, the treatment inoculated with S. cerevisiae had the highest population with 8.21 log10 cells/g, followed by T. delbrueckii with 7.31 log10 cells/g. In addition, the monitoring of the yeasts in the SIAF control treatment showed that the yeast S. cerevisiae obtained the highest presence in the coffees without inoculation, with 6.98 log10 cells/g in the natural coffee and 7.89 l log10 cells/g in the pulped coffee. Followed by the T. delbrueckii yeast with 7.21 log10 cells/g in natural coffee and 6.93 log10 cells/g in pulped coffee, and the yeast with the lowest population present was C. parapsilosis with a population of 3.32 log10 cells/g in natural coffee and 2.98 log10 cells/g in pulped coffee. The conventional processing was the treatment with the lowest yeast population in both methods. For example, the yeast S. cerevisiae with 2.44 log10 cells/g obtained the highest population in the natural coffee, and the yeast C. parapsilosis with 2.92 log10 cells/g had the highest population in the pulped coffee. 3.2. Evaluation of organic acids The acids (acetic, citric, lactic, malic, oxalic, succinic, and tartaric) are present in the coffee at the beginning (freshly harvested coffee before fermentation for 0 h) and at the end (end of drying for 480 h) of processing were evaluated in natural and pulped coffees. At the beginning of the processing (freshly harvested coffee), citric, malic, and succinic acids were identified (Table 2); oxalic, tartaric, lactic, and acetic acids were not identified. The acids concentration showed significant differences (p ≤ 0.05) between the natural and pulped coffee processing, however, no difference was obtained among fermentations. For example, citric acid was detected in high concentrations in natural (4.85 g/kg) and pulped (3.01 g/kg) coffee at the beginning of the process (0 h). 41 By the end of processing, citric, malic, succinic, and lactic acids were detected, and high lactic acid production was observed in coffees fermented by SIAF (Table 2). In addition, natural coffee had a higher production of acids (citric, malic, succinic, and lactic acids) than pulped coffee in the treatments processed by SIAF. On the other hand, conventional processing showed higher production of acids (citric, malic, succinic, and lactic acids) in pulped coffee than in natural coffee. Significant differences (p ≤ 0.05) were found in acid production between the treatments. T. delbrueckii had the highest citric acid production, with 7.29 g/kg in natural coffee and the conventional process with 4.04 g/kg for pulped coffee. For succinic acid, the SIAF control presented the highest concentration with 2.38 g/kg in natural coffee and in pulped coffee conventional processing with 1.60 g/kg. For lactic acid, S. cerevisiae was 12.15 g/kg in natural coffee, and C. parapsilosis was 4.36 g/kg in pulped coffee. Moreover, conventional processing obtained the highest yields for malic acid, with 2.02 g/kg in natural coffee and 2.75 g/kg in pulped coffee. 3.3. Volatile compounds A total of 40 volatile compounds were detected between green (14) and roasted (39) coffees (Supplementary Table S.2). These compounds were classified into 14 groups: pyrroles (6), furans (6), esters (5), acids (4), alcohols (3), ketones (3), pyrazines (3), pyridines (2), lactones (2), aldehydes (2), phenols (1), pyrans (1), thiophenes (1) and others (1) (Flamet, 2001). Ethyl oleate, octadecanoic acid, and ethyl ester were detected only in coffee processed by natural coffee in green and roasted coffee. Principal component analysis (PCA) analyzed the GCMS results and correlated the volatile compounds detected with each treatment and processing method. Figure 2 shows the PCA results, with numbers (1) for green coffee and (2) for roasted coffee and letters (A) for natural and (B) for pulped coffee. In green coffee, PC1 and PC2 explained 79.41% and 77.49% of the total variance for natural and pulped coffee, respectively. 42 In natural green coffee, there is a relationship between C. parapsilosis yeasts and the compounds linoleic acid ethyl ester, hexanoic acid, 2-methylbutyl ester, hexadecanal, and n- nonadecanol, and between SIAF control 2-pentadecanone, the conventional process with compound pentadecanal and S. cerevisiae and T. delbrueckii do not show a direct correlation with any specific compound. In roasted coffee, PC1 and PC2 explained 77.77% and 77.79% of the total variance for natural and pulped coffee, respectively. In natural coffee, the SIAF control was related to Compounds 2-thiophenemethanol, ethanone, 1-(1H-pyrrol-2-yl), and 1H-pyrrole, 1-(2- furanylmethyl). The conventional process with compounds 3- pyridinol and 5- hydroxymethylfurfural, C. parapsilosis with compound phenylethyl alcohol, T. delbrueckii with 1H-pyrrole-2-carboxaldehyde, 2- pentadecanone, and decanoic acid, and S. cerevisiae did not show a direct correlation with any specific compound. In pulped green coffee, SIAF control is related to hexanoic acid, 2-methylbutyl ester, and the conventional process is related to caffeine, T. delbrueckii, C. parapsilosis and S. cerevisiae did not present a correlation. A correlation was observed between C. parapsilosis yeast and the SIAF control for pulped roasted coffee. The SIAF control showed a correlation with the Compounds 2(5H)-furanone, 4-methyl-5H-furan-2-one, 2-thiophenemethanol, 1H-pyrrole-2- carboxaldehyde, and benzyl alcohol, C. parapsilosis with 3-methyl-2-pyrazinylmethanol, 2- furanmethanol, ethanone, 1-(1H-pyrrol-2-yl), 2-heptadecanone, 1H-pyrrole, 1-(2- furanylmethyl), 1H-pyrrole-2-carboxaldehyde, 1-methyl, indole, and ethanone, 1-(2-furanyl), S. cerevisiae with n-hexadecanoic acid, and the conventional process, and T. delbrueckii did not show any correlation. 3.4. Tetrazolium test Table 3 shows the results of the tetrazolium test, with significant differences (p ≤ 0.088) 43 between treatments and processing methods and between the times of freshly harvested coffee before fermentation (0 h) and coffee at the end of drying (480 h). In general, we can say that the pulped coffee processing method has caused less embryonic damage than natural coffee processing. However, only the treatment of natural coffee conventionally obtained the same results as coffee before treatments (0 h). 3.5. Electrical conductivity (E.C.) Before processing, at time 0, a statistically significant difference (p ≤ 0.05) was found between the processing methods (Table 4). At the end of processing (480 h), the results showed statistically significant differences (p ≤ 0.05) between processing methods and between treatments. The conventional processing obtained the lowest electrical conductivity values in the natural (259.53 µS.cm -1. g -1) and pulped (209.00 µS.cm -1. g -1) methods, indicating the better physiological quality of coffee by this treatment. 3.6. Sensorial analysis Sensory analysis showed that all coffees scored above 80 and were classified as specialty coffees. When inoculated with T. delbrueckii (86.50), pulped coffee obtained the best scores; natural coffee showed better results with C. parapsilosis (85.90). The coffees processed by the conventional method obtained the lowest scores (83.75 for natural coffee and 84.25 for pulped coffee). Figure 3 shows the intensity of sensory attributes (sweetness, acidity, body, astringency, bitterness, and finish) that contributed to the final score for each treatment. Likewise, these coffees were characterized by aromas and flavors of citrus fruits, caramel, honey, chocolate, and chestnuts for natural coffee and flavors and aromas of citrus fruits, nuts, chocolate, caramel, and chestnuts for pulped coffee. In addition, the Q-graders detected aromas and fermented flavors (of wine) in the natural coffees processed by SIAF. 44 4. Discussion SIAF is a new technology applied to the fermentative processing of coffee in closed bioreactors, creating a modification in the fermentation environment by limiting the availability of oxygen and allowing the development of facultative aerobic microorganisms (Cassimiro et al., 2022; da Mota et al., 2022). The anaerobiosis caused by SIAF generates a decrease in cellular respiration in the seed, forced to carry out anaerobic respiration, which translates into greater consumption of nutrients to produce the energy necessary for maintenance and development functions, affecting the viability of the seed (Taiz et al., 2017). Kleinwächter and Selmar, (2010) demonstrated that the anaerobic process intensifies the consumption of sugars by the seed. Therefore, microbiological interactions are created that favor the development of yeasts through different metabolic pathways (Feldmann, 2012; Takagi et al., 2015). However, the growth of microorganisms during fermentation generates physicochemical changes in the beans, loss of water, and changes in organic compounds (acids, sugars, volatile) that provide additional flavors and aromas through the metabolites produced in this process, which can migrate to the bean, producing different flavors and aromas that favor the quality of a beverage (Evangelista et al., 2014; Silva et al., 2013). The use of yeast starter cultures (C. parapsilosis, T. delbrueckii, and S. cerevisiae) during coffee fermentation process has been used in different investigations (da Mota et al., 2022; Martins et al., 2022) showing the yeast’s ability to carry out fermentation and remain viable until the end of the drying process. In addition to guaranteeing the sensory quality of the beverage through the production of the desired sensory attributes. Epiphytic microorganisms participate in coffee fermentation, competing for available nutrients (pectin, sugars, amino acids, polysaccharides) among themselves and with starter cultures (Silva et al., 2013). The microbial metabolites produced can migrate to the interior of 45 the bean, altering the internal chemical composition of the bean and providing organic compounds (amino acids, sugars, volatile compounds) that modify the sensory profile of the coffee (Hadj Salem et al., 2020; Pereira et al., 2022; Wang et al., 2022). At the end of coffee processing, the inoculated yeasts (S. cerevisiae, C. parapsilosis, and T. delbrueckii) maintained populations at least 1 log above the populations found in the SIAF control and conventional processing. These yeasts were identified both in the SIAF control and in the conventional processing, which was expected, as these yeasts are naturally in coffee in populations between 102 and 106 cells/mL (Silva et al., 2013; Vilela et al., 2010). Through the generation of suitable environments for the growth of these microorganisms (presence and absence of oxygen), environmental conditions were different from the conditions outside the bioreactors (Cassimiro et al., 2022; da Mota et al., 2022), observing differences between the treatments in bioreactors and the conventional processing that was directly the terraces. T. delbrueckii and S. cerevisiae exceeded six log10 cells/mL in the SIAF control and four log10 cells/mL above conventional processing, thus demonstrating that SIAF favors the growth of these microorganisms. Coffee fruits naturally contain organic acids in their composition, such as citric, malic, and succinic acids, which influence the perceived acidity of the beverage (Bressani et al., 2021). However, acid degradation occurs during coffee fermentation, as well as an increase in their concentration, due to the metabolism of microorganisms (Ribeiro et al., 2017). In complex fermentative processes, these acids are used as a carbon source by the microbiota present, such as in the fermentation of citric acid by lactic acid bacteria (LAB), increasing or decreasing its concentration during coffee processing as a product generated by the metabolism of microorganisms (Martinez et al., 2019). These compounds will influence the perceived acidity in coffee, an essential attribute of coffee quality combined with sweetness, bitterness, and aroma, which improves the beverage's sweetness (Sunarharum et al., 2014). Therefore, 46 producing organic acids during coffee fermentation plays a promising role in creating specialty coffees with desired sensory characteristics (Cassimiro et al., 2022; Wang et al., 2019). Lactic acid, absent at the beginning of processing, becomes the main acid during fermentation, with the highest quantification compared to the other acids detected. Similar results were reported by da Mota et al. (2022). This lactic acid in the coffee is related to the decarboxylation of the malic acid by LAB, with a decrease in malic acid observed compared to that detected at the beginning of processing (Cassimiro et al., 2022; Leeuwenhoek, 1999). Furthermore, citric, malic, succinic and lactic acid in green beans affect the formation of volatile compounds during roasting, such as pyrazines, furans, and esters (Elhalis et al., 2021). The volatile compounds identified in green coffees, alcohols, esters, ketones, aldehydes, and caffeine, are responsible for aromas characteristic of coffee with aromas of citric fruits, nuts, and florals (Flamet, 2001; Sunarharum et al., 2014), indicating that the coffees were free of defects (rotted, over-fermented, brocaded, moldy coffees) (Elhalis et al., 2021). Roasted coffees had an increased number of volatile compounds due to the several reactions produced during roasting (Maillard reaction, Strecker degradation) (Flamet, 2001; Prakash et al., 2022). Thirty-nine compounds detected in 14 classes were dominated by seven classes: Pyrroles (7, provide sweet, smoky, herbaceous, mushroom, woody aroma), Furans (6, provide the characteristic aroma and flavor of