ANA PAULA PEREIRA BRESSANI SPECIALTY COFFEES FERMENTED AT DIFFERENT ALTITUDES: INFLUENCE OF YEAST CO-INOCULATION ON CHEMICAL AND SENSORY COMPOSITION LAVRAS - MG 2021 ANA PAULA PEREIRA BRESSANI SPECIALTY COFFEES FERMENTED AT DIFFERENT ALTITUDES: INFLUENCE OF YEAST CO-INOCULATION ON CHEMICAL AND SENSORY COMPOSITION Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, área de concentração em Microbiologia de Alimentos e Processos Fermentativos, para a obtenção do título de Doutora. Profa. Dra. Rosane Freitas Schwan Orientadora Prof. Dr. João Batista Pavesi Simão Dra. Nádia Nara Batista Coorientadores LAVRAS - MG 2021 Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema de Geração de Ficha Catalográfica da Biblioteca Universitária da UFLA, com dados informados pelo(a) próprio(a) autor(a). Bressani, Ana Paula Pereira. Specialty coffees fermented at different altitudes: Influence of yeast co-inoculation on chemical and sensory composition / Ana Paula Pereira Bressani. - 2021. 146 p. : il. Orientador(a): Rosane Freitas Schwan. Coorientador(a): João Batista Pavesi Simão, Nádia Nara Batista. Tese (doutorado) - Universidade Federal de Lavras, 2021. Bibliografia. 1. Cafés especiais. 2. Co-inoculação de leveduras. 3. Consumidores. I. Schwan, Rosane Freitas. II. Simão, João Batista Pavesi. III. Batista, Nádia Nara. IV. Título. ANA PAULA PEREIRA BRESSANI CAFÉS ESPECIAIS FERMENTADOS EM DIFERENTES ALTITUDES: INFLUÊNCIA DA CO-INOCULAÇÃO DE LEVEDURAS NA COMPOSIÇÃO QUÍMICA E SENSORIAL SPECIALTY COFFEES FERMENTED AT DIFFERENT ALTITUDES: INFLUENCE OF YEAST CO-INOCULATION ON CHEMICAL AND SENSORY COMPOSITION Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, área de concentração em Microbiologia de Alimentos e Processos Fermentativos, para a obtenção do título de Doutora. APROVADA em 26 de abril de 2021. Dra. Patrícia Campos Bernardes UFES Dra. Jussara Moreira Coelho UFES Dra. Cíntia Lacerda Ramos UFJM Dr. Disney Ribeiro Dias UFLA Profa. Dra. Rosane Freitas Schwan Orientadora Prof. Dr. João Batista Pavesi Simão Dra. Nádia Nara Batista Coorientadores LAVRAS - MG 2021 Aos meus pais, exemplos de ética, perseverança e amor incondicional. Amo vocês. Dedico AGRADECIMENTOS Sempre que nos deparamos com momentos que nos conduzem a uma nova etapa da vida, nos lembramos de que não atingimos nossas metas sozinhos. À Deus, pelo dom da vida, por me dar sabedoria, guiar e iluminar meus passos. À professora Dra. Rosane Schwan, pela confiança em meu trabalho, ensinamentos e por todas as oportunidades que me proporcionou ao longo dessa jornada. Aos meus coorientadores, professor João Batista Pavesi Simão e Dra. Nádia Nara Batista, pela dedicação, direcionamentos e ensinamentos. À minha família, pelo amor, incentivo e força para continuar lutando em todos os momentos em que pensei em desistir. Ao meu namorado, Márcio, por estar sempre ao meu lado com amor e paciência. Às minhas amigas Aline e Jayne, pela presença sempre alegre, apoio, conselhos e por serem pessoas tão iluminadas. Aos amigos, colegas e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos. Aos amigos, colegas e funcionários do Programa de Microbiologia Agrícola, em especial Aline, Silvia, Nádia, Gabi, Priscila, Cidinha, Ivani e Rose. À Caparaó Jr., professoras Patrícia e Jussara, por toda ajuda e auxílio durante os experimentos. À equipe UFLArunnes e ao treinador Alberto, por me ajudarem a cuidar do corpo e mente. À Universidade Federal de Lavras e aos Programas de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos e em Microbiologia Agrícola, pela oportunidade de realizar este trabalho. Ao CNPQ e CAPES, pela concessão da bolsa de doutorado. À FAPEMIG pelo apoio. “A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.” (Arthur Schopenhauer) RESUMO GERAL Os cafés especiais estão ganhando mais espaço no mercado brasileiro e as mudanças na produção, processamento, comercialização e cultura dos consumidores são perceptíveis. É indiscutível que o uso de culturas iniciadoras selecionadas no processo fermentativo incrementa a qualidade dos cafés. Entretanto, o comportamento desses microrganismos pode ser diferente dependendo da variedade, método de processamento e altitude onde o café é cultivado. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo: (i) utilizar metodologias metabolômicas, químicas e sensoriais para avaliar a qualidade de cafés fermentados da cultivar Catuaí vermelho IAC-44 em diferentes altitudes (600 e 1.200 m), localizados na região do Caparaó; (ii) analisar o conhecimento e as perspectivas dos consumidores sobre cafés e investigar como a informação pode influenciar a experiência sensorial dos consumidores. Para isso, cafés maduros foram colhidos manualmente e separados em bateladas de 20 Kg, representando sete tratamentos mais o controle em cada altitude. As culturas iniciadoras - Saccharomyces cerevisiae CCMA 0543, Candida parapsilosis CCMA 0544 e Torulospora delbrueckii CCMA 0684 - foram inoculadas, isoladas e em co-inoculação. O controle não foi inoculado. A fermentação dos frutos inteiros foi conduzida por 72 h em biorreatores fechados. Então, os cafés foram colocados em terreiro suspenso até atingir umidade em torno de 11-12%. Amostras foram coletadas e congeladas até a realização das análises. Foi analisado a melhoria da qualidade da bebida do café cultivado em baixa altitude, por meio da inoculação de leveduras durante a fermentação por via seca. As análises foram realizadas por cromatografia líquida e gasosa, espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e prova de xícara. Diferenças nos compostos químicos entre os cafés inoculados e o controle, tanto para o grão verde, quanto torrado, foram observadas. A fermentação aumentou a qualidade dos cafés de baixa altitude e a combinação de leveduras não Saccharomyces (C. parapsilosis CCMA 0544 e T. delbrueckii CCMA 0684) apresentou a maior nota sensorial (85), sendo a mais indicada para esse processo. O segundo tópico abordado neste trabalho foi a influência da fermentação com culturas iniciadoras em relação aos compostos bioativos, químicos e sensoriais de cafés produzidos em alta altitude. O teor de polifenóis total e antioxidantes estão fortemente relacionados com o fim da fermentação em biorreator fechado e após a torra. O teor de trigonelina apresentou correlação moderada e negativa com a fermentação e torra. Notas frutadas, cítricas e de vinho foram encontradas apenas nos tratamentos inoculados. O tratamento co-inoculado com as três leveduras apresentou maior nota sensorial (86.9). O terceiro aspecto abordado, foi compreender as perspectivas e desejos dos consumidores de café através de um questionário digital com 1.005 participantes. O sabor chocolate é o mais esperado no café especial. O teste Check-all-that- Apply foi realizado com 101 consumidores, utilizando o mesmo café (sem e com informação). A análise sensorial mostrou que os consumidores podem ser influenciados pelas informações. Portanto, a co-inoculação de leveduras na fermentação do café é uma alternativa altamente promissora para cafés de baixa e alta altitude. Além disso, os cafés especiais fermentados devem ser mais divulgados aos consumidores. Palavras-chave: Fermentação. Cafés especiais. Co-inoculação de leveduras. Composição química. Consumidores. GENERAL ABSTRACT Specialty coffees are gaining more space in the Brazilian market, and the changes in production, processing, marketing, and consumer culture are noticeable. Unquestionably, the use of selected starter cultures in the fermentation process improves the coffee quality. However, the microorganisms' behavior can be different depending on the variety, processing method, and altitude. Thus, this paper aims to (i) use metabolomics, chemical, and sensory methodologies to evaluate the quality of fermented coffees of the cultivar Catuaí vermelho IAC- 44 at different altitudes (600 and 1,200 m) located in the Caparaó region. (ii) analyze consumers’ knowledge and perspectives on coffees and investigate how information can influence consumers’ sensory experience. For this, the coffee cherries were harvested manually and separated into batches of 20 kg, representing seven treatments plus control at each altitude. The starter cultures - Saccharomyces cerevisiae CCMA 0543, Candida parapsilosis CCMA 0544, and Torulospora delbrueckii CCMA 0684 - were inoculated, isolated, and in co- inoculation. The control was performed without inoculation. Fermentation of whole fruits lasted 72 h in closed bioreactors. Then, the coffees were transferred to the suspended terraces until 11- 12% moisture. Samples were collected and frozen for chemical analysis. We studied the improving coffee beverage quality cultivated at low altitudes through inoculation of yeast during fermentation in dry processing. The analyzes were performed using liquid and gas chromatography, Fourier transforms infrared spectroscopy (FTIR), and cup testing. Differences in chemical compounds were observed between the inoculated coffees and the control, both for green and roasted beans. Fermentation improved the quality of low-altitude coffees, and the co- inoculation of non-Saccharomyces yeasts (C. parapsilosis CCMA 0544 and T. delbrueckii CCMA 0684) had the highest sensory score (85), being the most suitable for this process. The second topic addressed in this work was the influence of fermentation with starter cultures concerning the bioactive, chemical, and sensory compounds of coffee produced at high altitudes. The content of total polyphenols and antioxidants is strongly correlated with the end of fermentation in a closed bioreactor and after roasting. The trigonelline content has a moderate and negative correlation with fermentation and roasting. Fruity, citric, and wine notes were found only in inoculated treatments. The co-inoculated with the three yeasts showed the highest sensory score (86.9). The third aspect addressed was understanding the perspectives and desires of coffee consumers through a questionnaire in a digital format with 1,005 participants. The chocolate flavor is still the most expected in specialty coffee. The Check-all-that-Apply (CATA) test was carried out with 101 consumers using the same coffee (without and with information). Sensory analysis showed that consumers could be influenced by information. Therefore, co-inoculation of yeasts in coffee fermentation is a promising alternative for low and high-altitude coffee. Also, specialty fermented coffees should be made more widely available to consumers. Keywords: Fermentation. Specialty coffees. Yeast co-inoculation. Chemical composition. Consumers. SUMÁRIO PRIMEIRA PARTE ............................................................................................ 10 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 10 2 REFERENCIAL TEÓRICO .............................................................................. 12 2.1 Café: características gerais ................................................................................. 12 2.2 Processamento pós-colheita do café ................................................................... 13 2.3 Fatores que influenciam a qualidade do café .................................................... 15 2.4 Características e importância do café na região do Caparaó .......................... 19 2.4.1 Efeito da altitude .................................................................................................. 20 2.5 Processo fermentativo do café e a utilização de culturas iniciadoras ............. 20 2.6 Análise sensorial de cafés especiais .................................................................... 22 3 CONSIDERAÇÕES GERAIS ............................................................................ 25 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 26 SEGUNDA PARTE ............................................................................................. 36 ARTIGO 1 - CO-INOCULATION OF YEASTS STARTERS: A STRATEGY TO IMPROVE QUALITY OF LOW ALTITUDE ARABICA COFFEE ........................................................................................... 36 ARTIGO 2 - CHARACTERIZATION OF BIOACTIVE, CHEMICAL, AND SENSORY COMPOUNDS FROM FERMENTED COFFEES WITH DIFFERENT YEASTS SPECIES .......................................................... 68 ARTIGO 3 - INTO THE MINDS OF COFFEE CONSUMERS: PERCEPTION, PREFERENCE, AND IMPACT OF INFORMATION IN THE SENSORY ANALYSIS OF SPECIALTY COFFEE ............................ 104 ANEXO A - Material complementar referente ao artigo 1 ........................... 127 ANEXO B - Material complementar referente ao artigo 2 ........................... 138 ANEXO C - Material complementar referente ao artigo 3 ........................... 144 10 PRIMEIRA PARTE 1 INTRODUÇÃO O café é uma das bebidas mais populares do mundo e o Brasil é o maior produtor e exportador mundial desse grão (VOLSI et al., 2019). Devido à bienalidade positiva, o país apresentou produção em torno de 63,08 milhões de sacas (60 kg) beneficiadas em 2020, correspondendo ao aumento de 27,9% em relação ao ano anterior. Os principais estados produtores de café no Brasil são: Minas Gerais, Espírito Santo, São Paulo e Bahia (COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO - CONAB, 2020). Os consumidores estão cada vez mais exigentes e conscientes dos processos de produção de seus alimentos, por isso, o consumo mundial de cafés especiais tem apresentado crescimento significativo nos últimos anos (UFER; LIN; ORTEGA, 2019). O mercado vem sendo afetado por novos produtos, pesquisas e cafeterias especializadas, incentivando mudanças na produção, processamento, comercialização, valorização e cultura dos consumidores (GUIMARÃES et al., 2019). Nesse sentido, uma compreensão da psicologia do consumidor e sua relação com as escolhas alimentares é essencial para atingir de maneira mais assertiva os diferentes nichos de consumidores de cafés. Fatores como: origem geográfica, clima, espécie, métodos de colheita, altitude, processamento e armazenamento, influenciam a qualidade da bebida (ABREU et al., 2019; BRESSANELLO et al., 2017; RIBEIRO et al., 2016), apresentando diferentes sabores e aromas, que são utilizados como parâmetros na caracterização de cafés especiais (SUNARHARUM; WILLIAMS; SMYTH, 2014). Por exemplo, durante a maturação dos frutos de café, o clima e a altitude irão desempenhar um importante papel em decorrência da temperatura, luz e água disponível (BERTRAND et al., 2006; BODNER et al., 2019). A diferença de altitude pode estar relacionada às alterações fisiológicas e morfológicas do fruto (ZHU et al., 2010), diversidade microbiana e, consequentemente, interferir no perfil dos compostos relacionados ao sabor do café (MARTINS et al., 2020). Entretanto, cafés cultivados em baixas altitudes são pouco estudados. Os frutos de café servem de substrato para o desenvolvimento de bactérias, leveduras e fungos filamentosos, suprindo-os de fontes de carbono e nitrogênio (SILVA et al., 2000). Durante a fermentação do café, microrganismos utilizados como culturas iniciadoras estão associados à degradação da pectina e outros carboidratos, produção de compostos voláteis desejáveis, e características sensoriais positivas e diferenciadas (BRESSANI et al., 2020; DE 11 BRUYN et al., 2017; ELHALIS et al., 2021; ESQUIVEL; JIMENEZ, 2012; EVANGELISTA et al., 2014b; SILVA et al., 2013). Além disso, algumas espécies de leveduras podem inibir o crescimento de fungos filamentosos produtores de toxinas através da inibição dos esporos e de ocratoxina A (SOUZA et al., 2017). Estudos de Bressani et al. (2018; 2020), da Mota et al. (2020); Evangelista et al. (2014a; 2014b), Martinez et al. (2017) e Ribeiro et al. (2017) têm demonstrado que leveduras como Saccharomyces cerevisiae, Candida parapsilosis e Torulospora delbrueckii melhoram a qualidade sensorial do café, apresentando notas de caramelo, herbáceo, frutas vermelhas, frutas cítricas, caju, banana e vinhoso, podendo variar devido ao tipo de processamento, variedade e região produtora. Portanto, um estudo mais avançado sobre essas variáveis, juntamente com as interações que ocorrem durante o processo fermentativo, é necessário para o entendimento de como esses microrganismos podem afetar o sabor e aroma dos cafés de maneira positiva. Desta maneira, os objetivos do presente trabalho foram: (i) utilizar metodologias metabolômicas, químicas e sensoriais para avaliar a qualidade de cafés da cultivar Catuaí vermelho IAC-44 fermentados sem e com culturas iniciadoras - Saccharomyces cerevisiae CCMA 0543, Candida parapsilosis CCMA 0544 e Torulospora delbrueckii CCMA 0684 - isoladas e em co-inoculação, em duas altitudes (600 e 1.200 m), localizados na região do Caparaó; (ii) analisar o conhecimento e as perspectivas dos consumidores sobre cafés (commodity, especial e fermentado) e investigar como a informação pode influenciar a experiência sensorial dos consumidores. 12 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Café: características gerais O café é pertencente à família Rubiacea, gênero Coffea, sendo o C. arabica e C. canephora as principais espécies cultivadas (ESQUIVEL; JIMÉNEZ, 2012). A maioria das plantações de café no Brasil cultiva a Coffea arabica L., que fornece um produto de boa qualidade e é amplamente procurado pelo mercado consumidor (SILVA et al., 2016). O fruto de café é constituído de seis partes: exocarpo (casca), endocarpo (polpa), mesocarpo (mucilagem), pergaminho, película prateada e endosperma (semente), apresentando composição química complexa. A casca é lisa e resistente, com coloração verde em frutos verdes e, dependendo do genótipo, pode apresentar coloração vermelha, amarela ou laranja quando maduro. A polpa apresenta característica amarelada, fibrosa e doce, representando, em base seca, em torno de 29% do peso integral. O café em pergaminho é composto por α-celulose (40-49%), hemicelulose (25-32%), lignina (33-35%) e cinzas (0,5-1%). Apenas o grão de café é torrado e utilizado na preparação da bebida (ESQUIVEL; JIMÉNEZ, 2012). Os principais constituintes do café verde são carboidratos, compostos de nitrogênio - como proteínas, trigonelina e cafeína, lipídios, ácidos orgânicos e água, sendo que a maioria são precursores de aroma e sabor (BELITZ; GROSCH; SCHIEBERLE, 2009). Durante a torra, esses precursores de sabor/aroma são formados por meio de reações térmicas (WORKU et al., 2018), como a quebra de açúcares livres, aminoácidos, trigonelina e ácidos clorogênicos. Além disso, o grão também é constituído por celulose, minerais (potássio, magnésio, cálcio, sódio, ferro, manganês, rubídio, zinco, cobre, estrôncio, crómio, vanádio, bário, molibdênio, e cádmio), açúcares (sacarose, glicose, frutose, arabinose, galactose e manose), lipídios, tanino, polifenóis, ácido clorogênico e aminoácidos (alanina, arginina, asparagina, cisteína, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina e valina) (BELITZ; GROSCH; SCHIEBERLE, 2009). Muitos processos bioquímicos, fisiológicos e químicos que ocorrem durante o período de pré e pós-colheita podem resultar em cafés com grandes diferenças quanto à qualidade (ESQUIVEL; JIMÉNEZ, 2012). No que se refere às espécies, há uma diferenciação nas concentrações de diversos compostos interferentes na qualidade do café, como cafeína, ácido clorogênico, aminoácidos, entre outros. Além disso, o conhecimento dos compostos químicos do café pode permitir a detecção de adulterações após a moagem, bem como, a diferenciação das espécies arábica e robusta (MONAKHOVA et al., 2015). 13 2.2 Processamento pós-colheita do café A colheita deve ser feita quando a maior parte dos frutos estiver maduros (BEZAME et al., 2021), a fim de evitar a presença de grãos imaturos (verdes), pretos e ardidos. Quando for realizada de forma não seletiva, é importante que se faça a separação dos frutos verdes/imaturos e secos, pois eles afetam negativamente a qualidade do café e o sabor da bebida (MIRANDA; DRUMOND; RONCHI, 2020). A maioria das características negativas da bebida são atribuídas ao controle inadequado durante a fermentação e secagem, promovendo a produção elevada de substâncias químicas, como ácido acético, butírico e propiônico, comprometendo a qualidade e gerando perdas econômicas adicionais (GONZALES-RIOS et al., 2007). De acordo com Brando e Brando (2014), há três formas distintas de realizar o processamento do café. Por via seca, via úmida e via semi-seca (descascado natural), como descrito na Figura 1, podendo ocorrer algumas variações quanto ao método de processamento ao realizar fermentações controladas. 14 Figura 1 - Fluxograma dos principais tipos de processamento do café. Fonte: Do Autor (2021). O processamento por via seca, também chamado de café natural, é muito utilizado no Brasil (BRANDO; BRANDO, 2014; CHALFOUN; ANGÉLICO; DE RESENDE, 2018), principalmente, em regiões tropicais onde o clima é seco no período da colheita. Nesse processamento, os frutos de café são secos como todas as partes que os constituem (DE BRUYN et al., 2017). “Os frutos colhidos em vários estádios de maturação (verde, cereja, passa e seco) podem, ou não, serem lavados e devem, preferencialmente, serem separados, a fim de melhorar a qualidade do café” (BORÉM, 2008, p. 129-156). O café deve ser espalhado em camadas finas, (5-8 cm) em terreiros de cimento ou suspensos, sendo amontoados à noite e revolvidos periodicamente durante o dia. Durante o período de secagem, também ocorre a fermentação microbiana natural, que influencia na qualidade final do produto. Cafés processados por via seca apresentam características sensoriais que os diferem dos cafés produzidos por via úmida, como sabor mais doce, mais corpo e maior complexidade (HAMEED et al., 2018; SELMAR; KLEINWÄCHTER; BITOF, 2014). 15 No processamento via úmida, o exocarpo e uma parte do mesocarpo são removidos mecanicamente. O processo de fermentação é realizado em tanques com um grande volume de água para a retirada do restante do mesocarpo que ficou aderido ao pergaminho. O tempo de fermentação pode variar, podendo ocorrer de 6 a 72 horas, dependendo da temperatura ambiente. Temperaturas mais altas e camadas mais espessas de mucilagem aceleram a fermentação (BRANDO; BRANDO, 2014). Então, os grãos são lavados com água limpa e secos em terreiros e/ou secadores rotativos (BRANDO; BRANDO, 2014; LEE et al., 2015). Os cafés produzidos com esse tipo de processamento são mais suaves, com acidez agradável e aroma complexo, se comparados aos naturais (SELMAR; KLEINWÄCHTER; BITOF, 2014). O café ainda pode ser processado pelo método semi-seco. Os frutos de café são despolpados e a fermentação ocorre diretamente sob o sol, em terreiro e/ou secadores rotativos (BRANDO; BRANDO, 2014; VILELA et al., 2010). “A secagem visa diminuir a umidade dos grãos para 12 a 11%. Então, o café deve ser armazenado em locais com umidade e ventilação adequados para não ocorrer alteração da qualidade” (BORÉM, 2008, p. 129-156). Desta forma, os grãos já processados (cafés crus) podem ser armazenados durante meses, sem alteração significativa do sabor (BELITZ; GROSCH; SCHIEBERLE, 2009). 2.3 Fatores que influenciam a qualidade do café “O café de boa qualidade pode ser considerado como a bebida que apresenta sabor e aroma agradáveis, bom corpo, acidez natural e suavidade ao paladar. Deve possuir poucos defeitos, cor e aspecto homogêneos e estar de acordo com as normas higiênico-sanitárias” (BORÉM, 2004, p. 127), além de atender aos gostos dos consumidores. Por este motivo, a qualidade do café é muito importante nas relações comerciais, com enorme influência sobre o preço do produto e crescente demanda por cafés especiais (GUIMARÃES et al., 2019). O perfil químico dos compostos precursores de aroma e sabor do café varia em função de diversos parâmetros, como fatores genéticos, ambientais, de colheita e pós-colheita, que podem afetar diretamente a qualidade da bebida (WORKU et al., 2018). Além disso, a microbiota presente naturalmente no café é diversificada e tem influência direta na qualidade da bebida (HAILE; KANG, 2019). A ação dos microrganismos durante a fermentação pode resultar em diferentes tipos de bebidas de café, diferenciadas em termos de corpo, sabor, aroma, acidez e adstringência (ESQUIVEL; JIMÉNEZ, 2012; RUTA; FARCASANU, 2021). Portanto, culturas iniciadoras podem ser utilizadas na fermentação do café para melhorar o controle do processo fermentativo e a qualidade sensorial da bebida, através da produção de ácidos 16 orgânicos e compostos voláteis (BRESSANI et al., 2020; BRESSANI et al., 2018; DA MOTA et al., 2020; ELHALIS et al., 2021; WANG et al., 2020). Dentre os componentes do grão, a cafeína é a mais conhecida. A quantidade deste constituinte pode variar de acordo com a variedade e espécie, sendo encontrados valores entre 0,8 e 1,4% (p/p) para café arábica e 1,7 a 4,0% (p/p) para robusta (BELITZ; GROSCH; SCHIEBERLE, 2009). A cafeína é um metabólito secundário nitrogenado, que influencia no corpo e amargor da bebida (SUNARHARUM; WILLIAMS; SMYTH, 2014). É o único composto termoestável, enquanto as outras substâncias como proteínas, arabinose, ácido clorogênico e trigonelina, podem ser transformados ou até mesmo destruídos pelo processo de torrefação (MUSSATTO et al., 2011). A presença de cafeína, trigonelina e compostos fenólicos, cujos principais representantes são os ácidos clorogênicos, interferem na atividade antioxidante e na qualidade da bebida do café (KIM et al., 2018). Kim et al. (2018) observaram que a trigonelina está correlacionada com a qualidade do grão verde e da bebida, já que este é um precursor da formação de diferentes classes de compostos orgânicos voláteis durante a torrefação (como pirroles e piridinas). Ácidos clorogênicos também contribuem para o sabor da bebida. Durante o processo de torra, a alta temperatura promove a isomerização e degradação dos ácidos clorogênicos, contribuindo para a composição volátil no café torrado (RODRIGUEZ; GUZMAN; HERNANDEZ, 2020). A acidez é um atributo importante do café e a presença de alguns ácidos é desejável, pois contribui para o sabor da bebida. Os ácidos cítrico, málico e succínico estão naturalmente presentes no café (EVANGELISTA et al., 2014b) e favorecem as características sensoriais. Outros ácidos como o acético, butanoico, fórmico, hexanoico, isovalérico e propanoico, também podem ser encontrados no café (PEREIRA et al., 2019), mas dependendo da concentração, podem se tornar indesejáveis. Entretanto, esses compostos se decompõem durante o processo de torrefação e geram metabólitos importantes, como piridinas e pirróis (POISSON et al., 2018; SUNARHARUM; WILLIAMS; SMYTH, 2014). Os ácidos também estão envolvidos na reação com os ácidos clorogênico e quínico durante a torrefação, para formar as lactonas, que também, podem influenciar o aroma do café (SUNARHARUM; WILLIAMS; SMYTH, 2014). A sacarose é responsável por até 9% do peso seco dos grãos verdes de café arábica. Glicose, frutose e pectina são os principais componentes do mesocarpo. O endocarpo e a película prateada são ricos em celulose, hemicelulose e monossacarídeos. A semente também é rica em carboidratos solúveis (arabinose, frutose, galactose, glicose, sacarose, rafinose e estaquiose) e insolúvel (celulose e hemicelulose), com 59-61% de peso seco (ESQUIVEL; 17 JIMÉNEZ, 2012; POISSON et al., 2018). As diferenças nas concentrações de frutose e glicose estão relacionadas aos diferentes processos. No entanto, outros açúcares de baixo peso molecular não são significativamente afetados pelos métodos de processamento (KNOPP; BYTOF; SELMAR, 2006). Os carboidratos são importantes para o desenvolvimento da cor, sabor e aroma do café, principalmente, por meio da reação de Maillard e da acidez da fermentação após a torrefação (WORKU et al., 2018). A formação do aroma do café é atribuída às reações de Maillard (reações entre aminoácidos e açúcares redutores, que após uma complexa cascata de reações durante o aquecimento, resultam na formação de substâncias marrons (melanoidinas)). Nessa etapa são formados compostos voláteis que conferem aroma característico aos produtos termicamente processados, juntamente com outras reações catalisadas termicamente, que ocorrem durante a torrefação (BATISTA et al., 2016; SENINDE; CHAMBERS IV, 2020). De acordo com Hwang, Chen e Ho (2012), os aminoácidos ligados à proteína podem contribuir para a formação volátil. Quantidades mais altas de proteína no café correlacionaram- se com uma maior concentração de pirazinas. Além disso, os autores relacionaram o café de coloração mais clara com maior teor de proteína, demonstrando a importante contribuição das proteínas na formação de voláteis e na cor do café. Por isso, os precursores de aroma do café (como por exemplo, açúcares, aminoácidos, compostos fenólicos) são primordiais na formação de compostos voláteis durante a torrefação, sendo que alterações das concentrações desses precursores do aroma correspondem às diferenças nos perfis voláteis e aroma do café torrado, tornando-o responsável pela qualidade da bebida (LEE et al., 2015), além do desenvolvimento de características de sabor e cor (devido a pirólise de compostos orgânicos), como mostrado na Figura 2 (BELITZ; GROSCH; SCHIEBERLE, 2009). 18 Figura 2 - Representação das reações de formação de compostos voláteis ocorridas durante o processo de torra do café. Fonte: Ribeiro et al. (2009). As classes químicas voláteis mais abundantes em grãos verdes são álcoois, aldeídos e cetonas (BRESSANI et al., 2020; MARTINEZ et al., 2017). Então, a torra pode modificar a composição química do grão, formando compostos químicos com atributos desejáveis na bebida (BELITZ; GROSCH; SCHIEBERLE, 2009). Furanos são geralmente produzidos por açúcares, ácidos e ácidos graxos insaturados durante a torrefação e conferem aromas maltados e doces (HAMEED et al., 2018), como notas herbais, frutadas, malte e caramelo, enquanto as cetonas estão relacionadas às notas amanteigadas, caramelo ou frutadas (BRESSANELLO et al., 2017). Piridinas surgem, principalmente, da reação de Maillard, pirólise direta de aminoácidos ou pela degradação da trigonelina (podem apresentar notas amargas, torradas e adstringentes). As pirazinas apresentam aromas de nozes, terrosos, torrados, verdes e doce (BRESSANELLO et al., 2017; FLAMENT, 2002). Compostos fenólicos são formados da degradação térmica do ácido clorogênico (CGA) e conferem um aroma apimentado em uma quantidade diretamente proporcional à quantidade de CGA nas sementes (HAMEED et al., 2018). 19 2.4 Características e importância do café na região do Caparaó Na busca de um sistema de cultivo ambientalmente e economicamente sustentável, a produção de café brasileiro tem passado por diversas modificações. A agregação de valor, através da melhoria qualitativa, tem sido foco dos produtores nas últimas décadas. Neste contexto, a adição da indicação geográfica ao produto agrícola pode facilitar sua aceitação no mercado (RAMOS; FERNANDES; SOUZA, 2012). Além disso, diversificando os sistemas de produção do café, permite-se gerar produtos com características diferenciadas para diversos mercados consumidores (SILVA et al., 2016). A região do Caparaó está localizada em torno do Parque Nacional do Caparaó, na divisa entre Minas Gerais (municípios de Alto Caparaó, Caparaó, Manhumirim, Martins Soares, Alto Jequitibá e Espera Feliz) e Espírito Santo (municípios de Alegre, Divino de São Lourenço, Dores do Rio Preto, Guaçuí, Ibatiba, Ibitirama, Irupi, Iúna, Muniz Freire e São José do Calçado) (SANTOS; SIMÃO, 2015). A produção de cafés em fazendas situadas na região é quase que, exclusivamente, realizada por pequenos produtores, com o uso da mão de obra familiar e da parceria com outros produtores (FREDERICO, 2013). O Espírito Santo é o segundo maior estado produtor de café arábica do país e o principal produtor de café conilon, atingindo aproximadamente 64% da produção total do estado em 2020 (CONAB, 2020). Essa espécie é plantada em regiões ao norte e ao sul do estado, conhecida como Conilon Capixaba. Possui clima com temperatura média mais elevada, de 26 ºC, e altitudes menores que 500 m (FREDERICO, 2013). O Estado de Minas Gerais é o maior produtor brasileiro de café, tanto em volume, quanto em valor de produção. O estado possui a maior área plantada com a espécie Coffea arabica, correspondendo a 72,1% da área brasileira ocupada com essa espécie. Em 2020, a produção foi em torno de 34.647,1 milhões de sacas de 60 kg, correspondendo a quase 60% da produção nacional (CONAB, 2020). Em fevereiro de 2021, o Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI, 2021) concedeu o selo de Indicação Geográfica aos cafés arábicas da região. Com foco na produção de cafés especiais, cada vez mais, a região do Caparaó vem se destacando em concursos de café de qualidade, como Coffee of the Year e Cup of Excellence, garantindo melhores preços aos produtores e maior visibilidade da região (APOSTÓLICO et al., 2017). 20 2.4.1 Efeito da altitude Durante a maturação dos frutos de café, o clima e a altitude desempenham um importante papel, em decorrência da temperatura, luz e disponibilidade de água (BERTRAND et al., 2006). Plantas em altitudes mais elevadas possuem, por exemplo, maior exposição à irradiação e temperaturas médias mais baixas, alterando as respostas morfológicas e fisiológicas das plantas (ZHU et al., 2010). Os cafés de baixa altitude estão relacionados à não uniformidade dos grãos e à bebidas de baixa qualidade, porém, são pouco estudados (BODNER et al., 2019; NUGROHO; BASUNANDA; YUSIANTO, 2020; SCHOLZ et al., 2018). Em um trabalho recente, realizado por Worku et al. (2018), foi constatado que, em geral, a cafeína e ácidos clorogênicos diminuíram, enquanto a sacarose, a acidez e o sabor aumentaram com o aumento da altitude. Entretanto, o efeito da altitude nas propriedades do grão de café arábica verde pode ser afetado pelo teor de sombra e pós-colheita. Além disso, a diversidade microbiana é distinta para diferentes altitudes, interferindo no perfil dos compostos relacionados ao sabor do café (MARTINS et al., 2020; VELOSO et al., 2020). Em uma pesquisa realizada por da Paschoa et al. (2017), ficou evidenciado que, propriedades localizadas em terrenos de maior altitude e mais próximas ao Parque Nacional do Caparaó, produzem cafés mais bem pontuados, mesmo com mais dias de fermentação. Entretanto, para propriedades em menor altitude, um maior tempo de fermentação pode prejudicar a qualidade sensorial do café. A produção cafeeira em pequenas propriedades rurais, situadas em áreas montanhosas, tem custos altos que dificultam a permanência das famílias no campo (SANTOS; SIMÃO, 2015). Dessa maneira, para agregar valor ao café, os produtores começaram a trabalhar com a agroindustrialização e/ou a valorização de atributos regionais, culturais e ecológicos do processo produtivo, bem como aspectos trabalhistas (SIQUEIRA; SOUZA; PONCIANO, 2011). 2.5 Processo fermentativo do café e a utilização de culturas iniciadoras A fermentação do café ocorre logo após a colheita. O tempo necessário para que ocorra esta etapa irá depender do tipo de fermentação realizada. Entretanto, independentemente do processamento realizado, alterações físico-químicas, tais como, redução no teor de água e açúcares, e a formação de precursores voláteis irão ocorrer nos grãos (VAAST et al., 2006). 21 O objetivo da fermentação em todos os métodos de processamento é remover a mucilagem (LEE et al., 2015; PEREIRA et al., 2019) até a diminuição do teor de água ao final da secagem dos frutos de café e, consequentemente, gerar compostos que contribuam para a formação do sabor e aroma da bebida. Enzimas contidas nos frutos não são suficientes para degradar completamente a mucilagem. Dessa forma, é necessário que haja um crescimento microbiano que possa produzir enzimas (como poligalacturonases e pectina liases) para hidrolisar a pectina presente na mucilagem (SILVA et al., 2013). A poligalacturonase (PG) catalisa a hidrólise de ligações glicosídicas α-1,4 em ácido péctico (ácido poligalacturônico); pectina liase (PL) atua catalisando a pectina, liberando ácidos galacturônicos insaturados e a pectinametilesterase (PME) é responsável pela desesterificação do grupo metoxila da pectina, formando ácido péctico e metanol (RUTA; FARCASANU, 2021; SILVA et al., 2013). A microbiota presente naturalmente em frutos do cafeeiro é diversificada, incluindo bactérias, leveduras e fungos filamentosos, que influenciam na qualidade da bebida (MARTINEZ et al., 2019; PEREIRA et al., 2019; SILVA et al., 2000). De acordo com o tipo de processamento, a população microbiana de cada grupo pode ser alterada (DE BRUYN et al., 2017; EVANGELISTA et al., 2015; VILELA et al., 2010). Além disso, a falta de controle na fermentação pode impactar negativamente o aroma e sabor do café (LEE et al., 2015). Espécies de microrganismos foram submetidos a testes com base nas atividades de poligalacturonase, pectina liase e pectinametilesterase e muitos apresentaram a capacidade de atuar como cultura iniciadora no processo de fermentação. Várias leveduras foram identificadas como potenciais culturas iniciadoras, como Saccharomyces sp., Pichia sp. e Candida sp. que mostraram uma melhor atividade da enzima pectinolítica para a degradação eficiente da mucilagem durante o processo fermentativo (SILVA et al., 2013). Culturas iniciadoras podem atuar na melhoria da qualidade sensorial, agregando valor ao produto, reduzindo o tempo de processamento (SILVA et al., 2013) e inibindo fungos toxigênicos como Aspergillus carbonarius and Aspergillus ochraceus (SOUZA et al., 2017). Estirpes de P. anomala e P. kluyveri foram utilizadas como culturas iniciadoras, juntamente com bactérias do ácido lático em fermentação de café, e demonstraram capacidade de inibir o crescimento de fungos produtores de micotoxinas (MASSAWE; LIFA, 2010). Leveduras pectinolíticas utilizadas durante a fermentação do café podem acelerar o processo e a produção de ácidos orgânicos, e compostos voláteis podem contribuir para a qualidade da bebida (BRESSANELLO et al., 2017; BRESSANI et al., 2020; MARTINEZ et al., 2019). De acordo com Evangelista et al. (2014a), ácidos orgânicos e compostos voláteis 22 produzidos por leveduras utilizadas em seu estudo contribuíram para a qualidade final da bebida. O café submetido ao processo de fermentação apresentou maiores concentrações de compostos voláteis e aromas mais agradáveis. Pereira et al. (2015) estudaram o potencial da Pichia fermentans como cultura iniciadora em café da cultivar Catuaí pelo processamento via úmida. A inoculação aumentou a produção de compostos voláteis específicos (como acetaldeído, acetato de etilo e acetato de isoamila) e diminuiu a produção de ácido láctico durante o processo de fermentação. A análise sensorial das bebidas demonstrou que a utilização desta estirpe foi favorável para a produção de cafés de alta qualidade, obtendo percepção de sabor intenso de baunilha e aromas florais. Bressani et al. (2018) e Martinez et al. (2017) avaliaram a qualidade de café da cultivar Catuaí amarelo pelo processamento seco e semi-seco, utilizando dois métodos de inoculação e três leveduras como culturas iniciadoras durante a fermentação do café. A qualidade sensorial dos cafés inoculados foi melhor, se comparados aos cafés produzidos a partir da fermentação com microbiota selvagem. Além disso, o café processado por via seca inoculado com Saccharomyces cerevisiae CCMA 0543 apresentou um aumento de 4 pontos na nota sensorial, se comparado com o controle (sem inoculação), sendo significativamente diferente das outras amostras e caracterizada por notas de banana, caju, acidez cítrica e bom corpo. T. delbrueckii apresentou influência positiva na fermentação de cafés naturais, aumentando em 5 pontos a nota final, se comparado com a fermentação realizada sem inoculação de leveduras (DA MOTA et al., 2020). Outros estudos recentes relatam resultados promissores usando leveduras e bactérias juntas durante a fermentação úmida do café (VALE et al., 2019; WANG et al., 2020b). No entanto, a aplicação de culturas starter combinadas em cafés processados a seco é escassa. A co-inoculação de leveduras ainda não foi estudada, entretanto, pode intensificar os atributos sensoriais, diversificar ainda mais os descritores sensoriais, além de serem uma alternativa para diferentes regiões e altitudes. Estes resultados demonstraram que o emprego da fermentação controlada do café, através da utilização de culturas iniciadoras, promove a melhoria da qualidade sensorial da bebida, possibilitando melhor controle da fermentação e a previsibilidade do produto. 2.6 Análise sensorial de cafés especiais A análise sensorial é a ciência que utiliza os sentidos humanos (como sabor, aroma, cor e textura) para avaliar características ou atributos de um alimento ou produto (PALERMO, 2015). É crucial para determinar a aceitação do produto, qualidade e prazo de validade 23 (MBELA et al., 2018; SHARIF et al., 2017). Com a chegada da "Terceira Onda do Café", o termo “qualidade” passou a ser mais frequente e é classificado, principalmente, por meio de protocolos definidos pela Specialty Coffee Association (SCA) (SAMOGGIA; RIEDEL, 2018). As análises de cafés são realizadas por um painel de provadores treinados com certificação Q-Grader, que avaliam atributos de aroma/fragrância, sabor, gosto residual, acidez, corpo, uniformidade, equilíbrio, xícara limpa e doçura. Cada atributo recebe pontuação em uma escala de 6,0 a 10,0 pontos, com intervalos de 0,25. A pontuação final corresponde à soma total dos atributos avaliados. As amostras com pontuação total, igual ou superior a 80 pontos, são consideradas cafés especiais e podem ser subdivididas em muito bom (80-84,99), excelente (85-89,99) e excepcional (acima de 90 pontos). Os provadores também podem incluir descritores sensoriais para fornecer informações adicionais sobre cada café (SPECIALTY COFFEE ASSOCIATION - SCA, 2018). A padronização da metodologia sensorial é extremamente útil para produtores, compradores e degustadores, pois auxilia na compra e venda do café. No entanto, muitas vezes, o protocolo é modificado e adaptado a diferentes estilos de trabalho (GUTIÉRREZ-GUZMÁN; CORTÉS-CABEZAS; CHAMBERS, 2018). A opinião dos avaliadores Q-Graders nem sempre está correlacionada com as preferências do consumidor (DI DONFRANCESCO; GUZMAN; CHAMBERS, 2014), principalmente, pelo fato de os consumidores serem influenciados por fatores extrínsecos, como embalagem, marcas, informações, entre outros (BRESSANI et al., 2021; LI; STRELETSKAYA; GÓMEZ, 2019; SAMOGGIA; RIEDEL, 2018; SPENCE; CARVALHO, 2020). Diferentes metodologias sensoriais podem expandir as informações sobre as escolhas e desejos dos consumidores de café. A soma dos resultados de provadores treinados e consumidores podem atingir efetivamente diferentes segmentos de mercado. Diferentes testes sensoriais podem ser aplicados aos consumidores. Por exemplo, os testes de aceitação são utilizados com frequência e visam saber o quanto os provadores gostam ou não de uma amostra. Podem avaliar a aceitação global de diferentes processamentos, níveis de torra, métodos de preparo, entre outros, ou algum atributo específico (KWAK; JEONG; KIM, 2018; NGUYEN et al., 2016). Os testes de preferência podem expressar uma preferência entre duas (comparação emparelhada) ou mais amostras (teste de ordenação). Nesse caso, o avaliador saberá qual é a amostra mais/menos preferida e se há uma diferença significativa entre elas (LI; STRELETSKAYA; GÓMEZ, 2019). Além disso, essas metodologias podem ser aplicadas em conjunto com outros testes sensoriais descritivos para obter resultados completos. A análise sensorial descritiva fornece resultados detalhados, precisos, confiáveis e consistentes. Check-all-that-Apply (CATA) é um método de análise sensorial descritiva usado 24 para discriminar amostras e melhorar produtos (VALENTIN et al., 2012). Esta análise consiste em uma lista de atributos a partir dos quais os provadores devem selecionar todos os atributos que considerarem adequados para descrever a amostra. Os atributos podem ser escolhidos pelos avaliadores por meio de um grupo de foco ou, no caso de cafés especiais, por meio de descritores fornecidos pelos avaliadores Q-Graders. Essa metodologia é considerada simples, porém, sua limitação é que a metodologia não permite a classificação das amostras e não fornece intensidade. Além disso, o CATA requer muitos avaliadores (VALENTIN et al., 2012). Vários estudos recentes utilizaram o CATA na avaliação sensorial de cafés com consumidores (GIACALONE et al., 2019; HEO et al., 2019; PRAMUDYA; SEO, 2018). Espitia-López et al. (2019) utilizaram CATA para descrever amostras de cafés especiais no México e obtiveram uma avaliação eficiente das diferenças obtidas pelos diferentes métodos de preparo (expresso e prensa francesa). Ao utilizar o teste CATA, Bressani et al. (2021) perceberam que os participantes não conseguiram perceber todos os atributos descritos pelos Q-Graders. Além disso, relacionaram o café fermentado ao sabor cítrico, sendo influenciados pelas informações. Devido à complexidade do café, uma análise sensorial dinâmica, como Dominância Temporal das Sensações (Temporal Dominance of Sensations - TDS), poderia ajudar a entender os sabores percebidos ao longo do tempo (segundos). Esta análise permite avaliar os atributos percebidos como dominantes (a percepção mais marcante) (PINHEIRO; NUNES; VIETORIS, 2013). O TDS é uma ferramenta útil para avaliar diferentes produtos alimentícios e é amplamente utilizado em amostras de café. O método já foi aplicado na discriminação e caracterização de cafés fermentados (EVANGELISTA et al., 2014a, 2014b; RIBEIRO et al., 2017) e diferentes graus de torra (BARBOSA et al., 2019). Devido à fadiga sensorial, o número de amostras pode ser limitante para a utilização de algumas metodologias. O retorno de participantes em várias sessões também pode dificultar a realização de análises sensoriais. Por isso, a escolha de um (s) teste (s) sensorial (s) depende do objetivo e da qualidade da medição sensorial. Os testes fornecem informações úteis sobre a percepção humana sobre as características de um produto, mudanças nos ingredientes, processamento, embalagem e prazo de validade. Eles são essenciais no controle de qualidade e na pesquisa de marketing. A análise sensorial pode ajudar a entender as preferências e desejos dos consumidores de cafés especiais, criando uma melhor comunicação entre o mercado e o consumidor final. 25 3 CONSIDERAÇÕES GERAIS O processamento pós-colheita é uma etapa muito importante para garantir a qualidade do café. A fermentação melhora a qualidade da bebida e a inoculação de microrganismos selecionados, como culturas iniciadoras, contribui para obter características diferenciadas e com maior intensidade, padronização, além de inibir microrganismos indesejáveis. A presença de leveduras no café tem influenciado de forma positiva, principalmente, o perfil dos compostos voláteis e sensorial da bebida, aumentando a nota final dos cafés. A co-inoculação de leveduras ainda não foi estudada, entretanto, as informações obtidas sobre a composição química do café verde e torrado podem auxiliar na escolha da levedura mais indicada para cafés de diferentes altitudes. Conhecer as expectativas e preferência dos consumidores é essencial para detectar os mercados que podem ser explorados com maior precisão e qualidade. Por isso, combinar técnicas sensoriais (como prova de xícara e Check-all-that-Apply - CATA) maximiza e complementa a descrição das características sensoriais dos cafés especiais. 26 REFERÊNCIAS ABREU, G. F. et al. Raman spectroscopy: A new strategy for monitoring the quality of green coffee beans during storage. Food Chemistry, [Kidlington], v. 287, p. 241–248, July 2019. Disponível em: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0308814619303334. Acesso em: 22 jan. 2020. APOSTÓLICO, J. G. et al. Mapeamento de concursos de qualidade de café e resultados de capixabas premiados de 2010 a 2015. In: SIMÃO, J. B. P. (orgs.). Cafeicultura do Caparaó Resultados de Pesquisas, Porto Alegre: Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Espírito Santo, 2017. cap. 15, p. 216–231. BARBOSA, M. de S. G. et al. Dynamics of sensory perceptions in arabica coffee brews with different roasting degrees. 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Acesso em: 22 jan. 2020. 36 SEGUNDA PARTE ARTIGO 1 - CO-INOCULATION OF YEASTS STARTERS: A STRATEGY TO IMPROVE QUALITY OF LOW ALTITUDE ARABICA COFFEE Artigo publicado na Revista Food Chemistry Doi: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.130133 Ana Paula Pereira BRESSANI1, Silvia Juliana MARTINEZ2, Nádia Nara BATISTA2, João Batista Pavesi SIMÃO3, Disney Ribeiro Dias1, Rosane Freitas SCHWAN2* 1Departamento de Ciência dos Alimentos, Universidade Federal de Lavras – UFLA, Lavras, MG, Brasil 2Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras – UFLA, Lavras, MG, Brasil 3Curso de Tecnologia e Cafeicultura, Instituto Federal do Espírito Santo – IFES, Alegre, ES, Brasil 37 ABSTRACT This study aimed to improve the beverage quality of coffee grown at low altitudes by inoculating three yeasts species (Saccharomyces cerevisiae CCMA 0543, Torulaspora delbrueckii CCMA 0684, and Candida parapsilosis CCMA 0544) in a single and co- inoculation during the fermentation by dry processing. Important chemical compounds and groups were performed by liquid and gas chromatography and Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR). The inoculated coffees with yeast populations around 106 Log cell/g obtained the highest scores, and the co-inoculation with C. parapsilosis CCMA 0544 and T. delbrueckii CCMA 0684 had the highest score in the sensory analysis (85). Different descriptors were observed in each treatment, and the body, flavor, balance, and aftertaste are strongly related to C. parapsilosis CCMA 0544. The fermentation process improved the quality of low- altitude coffees, and the combination of non-Saccharomyces yeasts (C. parapsilosis CCMA 0544 and T. delbrueckii CCMA 0684) is the most indicated as starter cultures. Keywords: coffee fermentation, co-inoculation, low altitude, FTIR, Caparaó region, quality. 38 1. Introduction Coffee is a relevant commercial product consumed and appreciated globally. Coffea arabica reaches higher prices in the international market (ICO, 2020) due to its sensory properties, such as sweet, fruity, chocolate, floral, and caramel. Nowadays, specialty coffees have been gaining more market worldwide (Guimarães et al., 2019). Different aromas, flavors, and experiences demand coffee’s from different processes, resulting in alternatives for coffee lovers (Guimarães et al., 2019). The sensory analysis carried out by Q-Graders is one of the most important factors considered during specialty coffee vending. However, to unravel the sensory differences, key compounds (organic acids, carbohydrates, volatile compounds, proteins, and fatty acids) related to quality must be evaluated. For example, acidity is an attribute evaluated during cup tasting (Specialty Coffee Association, 2018), and some organic acids are correlated with the coffee acidity (Martins et al., 2019). However, not all acids are desirable (propionic and butyric acid have an unpleasant aroma and taste in coffee). During the different phases before and after harvesting, their concentration is susceptible to variations. The coffee flavor complexity is mainly attributed to the volatile compounds, making their analysis essential. Volatile compounds are identified through Gas chromatography-mass spectrometry (GC–MS) techniques. However, other techniques exist, such as FTIR, which identifies quality parameters, defects, and bioactive compounds faster (Belchior et al., 2019); simultaneously, this technique can identify different volatile groups generated after fermentation. By implementing both techniques, the resulted data is maximized and complemented. Coffee composition is affected by geographical origin, climate, altitude, species, harvesting methods, processing, and storage (Abreu et al., 2019; Bressanello et al., 2017). Many authors highlighted altitude as an essential factor in coffee quality. In Martins et al. (2020), 39 altitude affected the microbial diversity and interfered in the compounds profile related to coffee flavor. Veloso et al. (2020) observed a higher interaction between fungi-fungi and fungi- bacteria in low-altitude coffee. Low-altitude coffees are associated with ununiform beans and lowquality beverages, making them poorly studied (Bodner et al., 2019; Tolessa et al., 2017). Considering the previous perspective and the influence of altitude, coffees cultivated at low altitudes would hardly have quality. Therefore, the post-harvest processes are also essential to maintain and increase coffee quality. Fermentation can occur regardless of the post-harvest processing (dry, semi-dry, or wet). Without control during this step may result in low-quality coffees (Lee et al., 2015). On the contrary, a controlled coffee fermentation is mainly performed to provide sensory experiences. Several studies have proven that starter cultures increase the coffee quality in different processing’s (da Mota et al., 2020; Bressani et al., 2018; Martinez et al., 2017). However, different yeasts can result in coffees with different sensory profiles. Therefore, the co-inoculation of these microorganisms can intensify and increase the coffee sensory descriptors. Also, yeast co-inoculation in low-altitude arabica coffee fermentations has not yet been studied. The Caparaó National Park has the third highest peak in Brazil, Pico da Bandeira (2,892 m of altitude), situated between Minas Gerais and Espírito Santo states- Brazil. The Caparaó region is known for its specialty coffee production and striking sensory characteristics, making the region acquire its origin Caparaó designation. Besides, their coffee richness and high quality had allowed farmers to participate in national competitions (Apostólico et al., 2017). However, the quality is not the same in lower altitudes (below 700 m). In this context, we propose to use yeast co-inoculation as a strategy to innovate the fermentation process, improve the sensory characteristics, and overturn low-quality coffees from low-altitudes into higher quality coffees, mainly in the Caparaó region (both of which have been little studied). Consequently, the present study aimed to inoculate three yeasts (Saccharomyces cerevisiae 40 CCMA 0543, Torulaspora delbrueckii CCMA 0684, and Candida parapsilosis CCMA 0544) singly and with co-inoculation for fermentation using low-altitude coffee processed via dry to improve beverage. Further, this study aimed to performed compounds analysis to comprehend starter culture’s influence on beverage quality. 2. Material and methods 2.1 Experimental design - coffee samples and yeasts inoculation The Catuaí Vermelho IAC-44 coffee variety, growing at 600 m of altitude (20°47'15.58"S of latitude and 41°39'32.62"O of longitude) in the Caparaó region (Guaçuí-ES Brazil) was used for this study. The raw coffees had a soluble solid content average of 18.6 soluble solids (º Bx). Selected coffee cherries (20 Kg for each treatment) were processed by the dry method, and fermentations were induced by yeast inoculation for 72 h (determined by temperature stabilization) in closed polypropylene bioreactors (self-induced anaerobic fermentation - SIAF). The average temperature during fermentation was 19.5 ºC (minimum temperature of 14.9 ºC and 24.8 ºC). The fermentations were divided into seven treatments carried out in triplicate and identified as: Sc treatment: inoculated only with Saccharomyces cerevisiae CCMA 0543; Cp treatment: inoculated only with Candida parapsilosis CCMA 0544; Td treatment: inoculated only with Torulaspora delbrueckii CCMA 0684; SC treatment: co- inoculation of Saccharomyces cerevisiae CCMA 0543 and Candida parapsilosis CCMA 0544; ST treatment: co-inoculation of Saccharomyces cerevisiae CCMA 0543 and Torulaspora delbrueckii CCMA 0684; CT treatment: co-inoculation of Candida parapsilosis CCMA 0544 and Torulaspora delbrueckii CCMA 0684; SCT treatment: co-inoculation of Saccharomyces cerevisiae CCMA 0543, Candida parapsilosis CCMA 0544 and Torulaspora delbrueckii 41 CCMA 0684. The spontaneous fermentation (control) was performed under the same conditions without inoculation. The yeasts were selected from the coffee environment (from dry and semi-dry processing). During their selection, they presented high pectin enzymatic activity and fermentative capacity, they produced desirable metabolites and increased the sensory notes of fermented coffees in different Brazilian regions (Bressani et al., 2018; da Mota et al., 2020; Evangelista et al., 2014; Martinez et al., 2017; Silva et al., 2013). The strains were reactivated in 10 mL of YEPG broth (20 g/L glucose, 10 g/L yeast extract, and 10 g/L soya peptone (HiMedia); pH 3.5) at 28 °C for 24 h, in increasing volumes, until they are reaching a concentration of approximately 108 cells/g of coffee. Then cells were centrifuged, resuspended in 100 mL of distilled water, and inoculated in the coffee cherries. After fermentation, the cherries were transferred to the greenhouse with suspended terraces until 11- 12% moisture (33 days). Samples (200 g) were collected before and after fermentation and at the end of drying for chemical analysis. 2.2 Dynamic of yeast populations during fermentation The yeast populations were monitored until the end of drying by real-time PCR (qPCR). DNA from strains and samples (0, 3, 9, and 36 days) were extracted by the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the "DNA Purification from Tissues" protocol with the manufacturer's instructions. The starter cultures were cultivated separately in YEPG medium (pH 3.5) at 28 °C for 24 h. Cells were estimated using a Neubauer chamber and were serially diluted (1:10) from 109 to 103 cells/mL. Each dilution was measured in triplicate. Specific primers were used for each species: SC-5fw 5´AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAG-3´ and SC-3bw 5´-TGAAATGCGAGATTCCCCT-3´ 42 (S. cerevisiae); SADH-F 5´-GCTGCGGCTTCAACTGATGC-3´ and SADH-R 5´- CTTGGTCACGAGCCTCC-3´ (C. parapsilosis); Tods L2 5´- CAAAGTCATCCAAGCCAGC-3´ and Tods R2 5´-TTCTCAAACAATCATGTTTGGTAG- 3´ (T. delbrueckii) (described in Bressani et al., 2018). The qPCR was carried out using the Rotor-Gene Q System (Qiagen, Hombrechtikon, ZH, Switzerland), according to Bressani et al. (2018), obtaining the following qPCR parameters: R2=0.997, slope=−3.812 and efficiency of 0.83 (S. cerevisiae), R2=0.991, slope=−3.628 and efficiency of 0.90 (C. parapsilosis), R2=0.996, slope=−3.517 and efficiency of 0.92 (T. delbrueckii). 2.3 Chemical compounds 2.3.1 Organic acids Citric, malic, succinic, oxalic, lactic, acetic, propionic, isovaleric, tartaric, and isobutyric acids were evaluated using a high-performance liquid chromatography system (Shimadzu Corp., Japan) in all treatments (0, 3, and 36 days). Three grams of each sample was homogenized in Falcon tubes with 20 mL of Milli-Q water by vortexing at room temperature for 10 min and were centrifuged twice at 12,745 RCF at 4 °C for 10 min. The supernatant pH was adjusted to 2.11 using a perchloric acid solution (16 mM) and filtered through a 0.22 μm cellulose acetate membrane. The resulting solution was then injected (20 μL) onto the chromatographic column (Shimpack SCR-101H -7.9 mm x 30 cm). The analysis was performed at a temperature of 50 ºC, using ultrapure water and perchloric acid (pH 2.1) as a mobile phase, at a flow rate of 0.6 mL/min. The acids were detected by UV absorbance (210 nm). Calibration curves were constructed with standards to quantify the chemical compounds (Evangelista et al., 2014). Malic and citric acid were purchased from Merck (Germany), lactic was purchased from Acros Organic (Belgium), oxalic, isovaleric, 43 tartaric, acetic, and succinic acids were purchased from Sigma-Aldrich (Germany), and butyric acid was purchased from Riedel-de Haen (Germany). 2.3.2 Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) FTIR analysis was conducted according to Liang et al. (2016) with minor modifications. The green and roasted ground coffee (2 g) was frozen for 24 h at -20 °C. The samples were subjected to a lyophilizing step for 24 h. FTIR spectra of coffee were recorded on a Digilab Excalibur, series FTS 3000 (United States), coupled to an attenuated total reflectance (ATR) accessory equipped with a ZnSe reflection crystal. The spectra were acquired at room temperature with 32 scans/samples in the range of 4000 to 400 cm−1 at a resolution of 4 cm−1 using OriginPro software. 2.3.3 Volatile compounds characterization Two grams of coffee samples (0, 3, 36 days, and roasted) were ground with liquid nitrogen and extracted by headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) (Evangelista et al., 2014). The compounds were analyzed using a Shimadzu QP2010 GC model equipped with mass spectrometry (MS) and a silica capillary Carbo-Wax 20M (30m x 0.25mm x 0.25 mm) column. The oven temperature was maintained at 50 ºC for 5 min. The temperature was then raised to 200 ºC in increments of 8 ºC/min and then maintained at 200 ºC for 15 min. Injector temperatures were kept at 230 ºC in splitless mode. The carrier gas (He) was maintained at a flow rate of 1.98 mL/min. The mass spectra detected was comparing with the NIST11/NIST11a database, and an alkane series (C10–C40) was used to calculate the retention index (RI); the RI values were compared with those found in the literature data (Amanpour & Selli, 2016; Toci et 44 al., 2020). The relative percentages of individual compounds were calculated from the total contents of volatiles on the chromatograms. 2.4 Sensory analysis The samples were roasted carried out around 8:30 - 9:30 minutes with the final temperature between 185 and 190 ºC (Probat Leogap model TP2 2, Curitiba, Brazil), until obtaining beans with a coloration approximately 60 on the Agtron scale (Specialty Coffee Association, 2018). Coffee beans were ground in an electric mill (Mahlkönig, EK43 model, Hamburg, Germany) before sensory analysis and stored under controlled temperature until analysis was performed. A panel of five expert coffee tasters, with Q-Grader Coffee Certificate, performed the sensory analysis using five cups for each sample (predetermined ratio of 8.25 ± 0.25 g per 150 mL of water). The attributes evaluated were fragrance, flavor, aftertaste, acidity, body, balance, uniformity, sweetness, clean cup, overall, and the total score (Specialty Coffee Association, 2018), besides sensory descriptors. 2.5 Statistical analysis Organic acid and qPCR data were analyzed using the Student-Newman-Keuls test (SNK) at 5% significance using the R statistics program. Heatmap and Tukey test at 5% significance were performed using the XLSTAT 2019 2.1 software for the volatile group and the sensory analysis's final scores, respectively. Pearson correlation coefficient was used for correlation tests through XLSTAT 2019 2.1 software. 3. Results 45 3.1 Yeasts population The qPCR technique made it possible to monitor the population of S. cerevisiae, C. parapsilosis, and T. delbrueckii in the fermentation until the end of drying the coffees with and without inoculation (Figure 1). At the beginning of fermentation, S. cerevisiae, C. parapsilosis, and T. delbrueckii populations in the spontaneous fermentation varied from 5 to 6 Log cell/g of coffee. S. cerevisiae and C. parapsilosis populations were lower in spontaneous fermentation when compared to inoculated treatments. T. delbrueckii population was the same in the spontaneous and inoculated treatments. The inoculated treatments with S. cerevisiae showed no significant change after 3 days of fermentation in a closed bioreactor. However, there was an increase in the S. cerevisiae population from drying until day 9 in all treatments. From that point on (day 9), the Sc and SC treatments showed no significant difference (Figure 1A). C. parapsilosis population was constant throughout the process, ranging from 5.82-6.41 Log cell/g of coffee. The CT and SCT treatments showed similar population dynamics of C. parapsilosis until the end of drying. Co-inoculation treatments showed a small increase in the population of C. parapsilosis on day 9, except for SC treatment. The Cp treatment had the largest population (6.3 Log cell/g of coffee), with a significant difference from the other treatments. The population of C. parapsilosis showed a significant increase from the beginning of day 9th of drying (6.41 Log cell/g of coffee) in spontaneous fermentation. However, at the end of drying, Cp treatment had the highest population (6.25 Log cell/g). The SC and SCT treatments showed no significant difference at the end of fermentation (6.09 and 6.06 Log cell/g) (Figure 1B). 46 Fig. 1. The monitoring of the yeast population (A) S. cerevisiae; (B) C. parapsilosis, and (C) T. delbrueckii was carried out from the beginning of fermentation in a closed bioreactor until the end of drying by qPCR. Treatments: ● Sc - S. cerevisiae; ● Cp - C. parapsilosis; ● Td - T. delbrueckii; ● SC - S. cerevisiae + C. parapsilosis; ● ST - S. cerevisiae + T. delbrueckii; ● CT - C. parapsilosis + T. delbrueckii; ● SCT - S. cerevisiae + C. parapsilosis + T. delbrueckii; ● Spontaneous fermentation. Lower case letters indicate a significant difference in means between treatments at each stage. at p < 0.05 by Student-Newman-Keuls. 47 CT and SCT treatments presented a similar dynamic behavior of the T. delbrueckii population throughout the processing. Compared to the other treatments, CT and SCT had evident differences at the end of fermentation. The treatments Td and ST showed no significant difference between them at the beginning of fermentation and drying 9th. The Td treatment had the highest population of T. delbrueckii (7.08 Log cell/g), and the SCT treatment had the lowest population (6.48 Log cell/g) at the end of drying (Figure 1C). 3.2 Organic acids determination Citric, malic, and succinic acids were detected in all treatments at the beginning of fermentation and remained until the drying (Table 1). From the beginning to the end of fermentation and drying, citric acid decreased except in Cp treatment. There was no significant difference in any treatment of citric and succinic acid production, and the malic acid content decreased in all treatments at the end of fermentation, except for spontaneous fermentation and Td treatment. The Sc and SC treatments showed the lowest concentrations of this compound (0.67 and 0.61 mg/g, respectively). Td treatment presented the highest lactic acid concentration at the end of the fermentation (1.83 mg/g), showing a significant difference from the other treatments. Among the treatments, the spontaneous fermentation presented the highest citric acid concentration (1.83 mg/g), followed by all the treatments inoculated with S. cerevisiae CCMA 0543 at the end of drying. Also, Cp treatment presented the highest succinic acid concentration (0.87 mg/g). Meanwhile, acetic acid was the primary acid detected. Moreover, the highest acetic acid concentration was found in the spontaneous fermentation (7.59 mg/g) and SCT treatment (7.21 mg/g), showing a significant difference among the other treatments (Table 1). 48 Table 1. Organic acids detected in coffee during fermentation with and without yeasts inoculation and drying. Acids Treatments (mg/g) Sc Cp Td SC ST CT SCT Spontaneous fermentation Citricns IF 2.22±0.10 1.22±0.05 2.10±0.12 1.88±0.02 2.07±0.15 1.65±0.25 1.74±0.27 1.98±0.33 FF 1.81±0.24 1.41±0.07 1.81±0.04 1.58±0.32 1.39±0.24 1.27±0.17 1.59±0.44 1.95±0.09 FD 1.40±0.27 1.11±0.22 0.93±0.06 1.34±0.18 1.34±0.16 1.00±0.16 1.24±0.15 1.83±0.05 Malic IF 3.21±0.38aB 1.53±0.20bC 2.70±0.37aC 2.59±0.26aC 4.49±0.19aA 3.39±0.04aB 2.31±0.17aC 2.55±0.11bC FF 0.67±0.09bCB 1.23±0.30bB 2.87±0.13aA 0.61±0.15cC 1.28±0.24bB 1.18±0.16bB 1.49±0.13bB 2.78±0.05bA FD 1.78±0.07cC 2.45±0.00aBC 2.90±0.13aB 2.02±0.22bC 1.90±0.17cC 2.03±0.06cC 2.02±0.19aC 3.40±0.03aA Succinicns IF 0.74±0.22 0.42±0.18 0.69±0.02 0.73±0.33 0.90±0.03 0.66±0.10 0.71±0.02 0.77±0.35 FF 0.87±0.17 0.56±0.19 0.60±0.04 0.60±0.12 0.49±0.15 0.43±0.01 0.58±0.23 1.05±0.12 FD 0.61±0.15 0.87±0.38 0.71±0.07 0.68±0.03 0.58±0.09 0.50±0.01 0.56±0.11 0.86±0.01 Lactic IF 0.00±0.00bB 0.00±0.00cB