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Título: Purificação e caracterização da tanase de Aspergillus sp. GM4 em fermentação submersa
Autor : Melo, Alessandra Gonçalves de
Primeiro orientador: Cardoso, Patrícia Gomes
metadata.teses.dc.contributor.advisor-co: Dias, Eustáquio Souza
Primeiro membro da banca: Guimarães, Luis Henrique Souza
Dias, Disney Ribeiro
Alves, Jose Guilherme Lembi Ferreira
Duarte, Whasley Ferreira
Área de concentração: Microbiologia Agrícola
Palavras-chave: Produção enzimática
Delineamento experimental
Metodologia de superfície de resposta
Aspergillus Ap.
Purificação
Caracterização
Tannase production
Experimental design
Response surface metodology
Purification
Caracterization
Data da publicação: 2013
Agência(s) de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Fundação de Amparo à Pesquisa do estado de Minas Gerais - FAPEMIG
Resumo: Três espécies do gênero Aspergillus; A. japonicus 246A, A. tamarii 3 e Aspergillus sp. GM4; foram previamente selecionadas e avaliadas quanto à produção de tanase nos meios Adams, Czapeck, Khanna, M5 e Vogel. Aspergillus sp. GM4 e meio Adams foram selecionados para a realização deste estudo. A produção enzimática foi avaliada utilizando diferentes indutores. A indução máxima foi obtida na presença de 2% de ácido tânico e 1% de metil galato. O delineamento de Plackett-Burman com seis variáveis foi realizado, visando encontrar aquelas que tivessem efeito significativo na produção da tanase. Agitação e MgSO4 foram selecionadas para o fatorial completo. No delineamento composto central rotacional houve um aumento de 2,66 vezes na produção de tanase quando comparado com os experimentos iniciais. Tanase de Aspergillus sp. GM4 foi purificada em duas etapas: com filtração da amostra utilizando uma membrana de corte de proteínas com massa molecular menor do que 100 kDa e cromatografia de exclusão molecular utilizando Sephacryl S-200. O rendimento da enzima na primeira etapa foi de 29% sendo purificada 29 vezes seguida de recuperação de 3,5% após uma purificação de 33 vezes. A massa molecular da enzima nativa foi estimada por cromatografia de exclusão molecular revelando uma proteína com massa molecular de aproximadamente 162 kDa. Tanase de Aspergillus sp. GM4 apresentou atividade ótima em temperatura de 40 °C e pH 6,0. A enzima manteve atividade no intervalo de pH 3,0 a 8,0 e no ensaio de estabilidade térmica apresentou atividade até 80°C, porém foi completamente inativada após 30 minutos. Tanase foi estável na presença de compostos tradicionalmente descritos como inibidores da atividade enzimática, tal como β-mercaptoetanol, EDTA e íons metálicos Pb2+ e Ba2+.
Three Aspergillus species; A. japonicus 246A, A. tamarii 3 and Aspergillus sp. GM4, were previously selected and had their ability to produce tannase tested in Adams, Czapeck, Khanna, M5 and Vogel culture medium for enzyme production. Aspergillus sp. GM4 and Adams medium were selected to perform this study. Tannase production was tested with different inducers. The highest induction ratio was in the presence of 2% tannic acid and 1% methyl gallate. The Plackett-Burman screening design was used and MgSO4 and agitation rate were selected for the complete factorial. The Central Composite Rotatable Design allows an increase of 2.66-fold in the enzyme production and reduced the costs of the medium production. The purification process of tannase from Aspergillus sp. GM4 was performed with filtration using 100 kDa molecular mass cut-off membrane and gel-filtration chromatography using Sephacryl S-200. The results showed 29% enzyme yield and 29-fold purification in the first step, while in the second step 3.5% enzyme yield and 33-fold purification was obtained. The native molecular mass was estimated by gel-filtration chromatography and resulted in a protein molecular mass of approximately 162 kDa. Aspergillus sp. GM4 tannase presented optimum temperature at 40°C and optimum pH at 6.0. The enzyme retained activity in pH 3.0-8.0 and the thermostability assay showed enzyme activity up to 80 °C, but after 30 min it was inactivated. Tannase was stable in the presence of compounds traditionally reported as inhibitors of the enzyme activity, such as β-Mercaptoethanol, EDTA and different metal ions, such as Pb2+ and Ba2+.
metadata.teses.dc.description: Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós Graduação em Microbiologia Agrícola, área de concentração em Microbiologia Agrícola, para a obtenção do título de Mestre.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/370
Publicador: UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
Idioma: pt_BR
Aparece nas coleções:DBI - Microbiologia Agrícola - Mestrado (Dissertações)

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