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Título: Caracterização imunofenotípica de gastrina, colecistoquinina, neuropeptídeo Y e peptídeo relacionado ao gene da calcitonina no sistema digestório do dourado Salminus brasiliensis
Autor(es): Pereira, Raquel Tatiane
Orientador: Rosa, Priscila Vieira
Coorientador(es): Vigliano, Fabricio Andrés
Okamura, Daniel
Membro da banca: Ferreira, Enio
Zangerônimo, Márcio
Peconick, Ana Paula
Murgas, Luis David Solis
Área de concentração: Produção e Nutrição de Não Ruminantes/Piscicultura
Assunto: Peptídeos
Imunohistoquímica
Peixe - Aparelho digestivo
Peptides
Immunohistochemistry
Fish
Data de Defesa: 3-Ago-2012
Data de publicação: 2013
Agência de Fomento: Fundação de Amparo à Pesquisa do estado de Minas Gerais (FAPEMIG)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ)
Referência: PEREIRA, R. T. Caracterização imunofenotípica de gastrina, colecistoquinina, neuropeptídeo Y e peptídeo relacionado ao gene da calcitonina no sistema digestório do dourado Salminus brasiliensis. 2012. 96 p. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2012.
Resumo: O sistema neuroendócrino difuso (SNED) compreende vários tipos de células do sistema gastrintestinal que produzem e secretam diferentes peptídeos, os quais exercem diversos efeitos sobre o processo digestório e o comportamento alimentar. O objetivo foi estudar, utilizando imunohistoquímica, a distribuição de células endócrinas do SNED imunopositivas aos peptídeos GAS, CCK-8, NPY e CGRP no sistema digestório de dourado Salminus brasiliensis. Foram utilizados 12 juvenis de dourado com peso de 144,8±21,7 g e comprimento total de 25,5±3,5 cm. Após 24 horas de jejum, os peixes foram eutanasiados e retiradas amostras em cinco diferentes segmentos: estômago: região pilórica estomacal (PE); intestino médio: cecos pilóricos (CP), alça 1 (A1) e alça 2 (A2) e intestino posterior (IP). As amostras de tecido foram fixadas em Bouin por 12 horas, colocadas em álcool 70% e processadas segundo métodos histológicos de rotina. Para a imunohistoquímica todas as reações foram feitas em câmara úmida e, nos procedimentos de lavagem, utilizou-se PBS 0,1 M. O bloqueio da atividade da peroxidase endógena e de ligações inespecíficas foi feito utilizando-se reagentes comerciais Dako®. As amostras foram incubadas com anticorpos primários policlonais (Bachem, EUA) contra GAS, CCK-8, NPY e CGRP. Posteriomente, foram incubadas com anticorpo secundário anticoelho EnVision+System/HRP, reveladas pelo método enzimático utilizando 3,3 tetra-hidrocloreto diaminobenzidina, DAB, e contracoradas com hematoxilina de Carazzi. O número médio de células endócrinas imunorreativas para cada peptídeo em cada segmento amostrado e em cada peixe foi determinado pela contagem total de células imunomarcadas. O número total de células foi contado, utilizando-se o microscópio, enquanto a área foi mensurada a partir da captura da imagem (objetiva de 20x) correspondende à área total de mucosa epitelial determinada usando o programa Image J. Os dados resultantes foram submetidos à ANAVA em esquema fatorial e as médias comparadas pelo teste de Tukey, a 5%. A utilização de anticorpos desenvolvidos contra peptídeos de mamíferos foi mostrada, pela primeira vez, ser eficiente na imunolocalização de GAS, CCK-8, NPY e CGRP no dourado. Todos os peptídeos foram identificados em todos os segmentos amostrados, ainda que escassos em determinados segmentos. O maior número de células endócrinas imunopositivas a GAS, CCK-8 e CGRP estava principalmente na região pilórica estomacal e nos cecos pilóricos. Já para o NPY, as células imunomarcadas estavam notavelmente restritas ao intestino médio do dourado.
The diffuse neuroendocrine system (DNES) constitutes various types of cells of the gastrointestinal system. These cells produce and secrete different peptides, which exert several effects on the digestive process and feeding behavior. The objective was to study, using immunohistochemistry, the distribution of endocrine cells of the DNES, immunoreactive to the peptides GAS, CCK-8, NPY and CGRP in the digestive system of dourado (Salminus brasiliensis). Twelve juvenile fish with weight of 144.8 ± 21.7 g and total length of 25.5 ± 3.5 cm were used. After 24 hours of fasting, the fish were euthanized and samples were collected of five different segments: stomach: pyloric region (PE); medium intestine: pyloric caeca (CP), loop 1 (A1) and loop 2 (A2); and posterior intestine (IP). The tissue samples were fixed in Bouin solution for 12 hours, placed in 70% alcohol and processed according to routine histological methods. For the immunohistochemistry, all the reactions were performed in a humid chamber and, in the washing procedures, PBS 0.1 M was used. The obstruction of the endogenous peroxidase and of non-specific bonds was done using commercial reagents Dako®. The samples were incubated with polyclonal primary antibody (Bachem, USA) against GAS, CCK-8, NPY and CGRP. Subsequently, they were incubated with anti-rabbit secondary antibody EnVision+System/HRP, revealed by the enzymatic method using 3.3 tetrahydrochloride diaminobenzidine, DAB, and counterstained with Carazzi hematoxylin. The average number of immunoreactive endocrine cells for each peptide in each sampled segment and in each fish was determined by the total count of immunostained cells. The total number of cells was determined using a microscope, while the area was measured capturing the image (20x objective) correspondent to the total area of epithelial mucosa ascertained using the program Image J. The resulting data were submitted to ANAVA in factorial scheme and the means compared by the Tukey test at 5%. The use of developed antibodies against mammal peptides was shown, for the first time, to be efficient in the immunolocalization of GAS, CCK-8, NPY and CGRP in dourado. All the peptides were identified in all the samples segments, despite being scarce in certain segments. The largest number of endocrine cells immunoreactive to GAS, CCK-8 and CGRP were, mainly, in the pyloric region of the stomach and in the pyloric caeca. As for the NPY, the immunostained cells were notably restricted to the medium intestine of the dourado.
Informações adicionais: Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, área de concentração Produção e Nutrição de Não Ruminantes/Piscicultura, para a obtenção do título de Mestre.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/1141
Publicador: UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
Idioma: pt_BR
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