Use este identificador para citar ou linkar para este item: repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/2727
Título: Estabelecimento e adaptação de métodos para detecção de vírus em sementes de pimentão, tomate, alface e feijão
Título(s) alternativo(s): Establishment and adaptation of methods for virus detection in seeds of sweet pepper, tomato, lettucce and bean
Autor : Almeida, João Eduardo Melo de
Primeiro orientador: Figueira, Antonia dos Reis
Primeiro membro da banca: Machado, José da Cruz
Gomes, Luiz Antônio Augusto
Área de concentração: Fitopatologia
Palavras-chave: Diagnose
Vírus
Semente
RT-PCR
DAS-ELISA
Teste biológico
Diagnostic
Virus
Seed
Biological test
Data da publicação: 13-Ago-2014
Referência: ALMEIDA, J. E. M. de. Estabelecimento e adaptação de métodos para detecção de vírus em sementes de pimentão, tomate, alface e feijão. 2009. 47 p. Dissertação (Mestrado em Fitopatologia)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2009.
Resumo: Apesar de já se ter indicações de diversas técnicas que podem ser utilizadas para a diagnose de vírus em sementes, não existem metodologias estabelecidas e otimizadas, para essa finalidade, nos laboratórios brasileiros. Assim sendo, esse trabalho foi realizado com o objetivo, primeiramente, de produzir sementes das seguintes plantas contaminadas com os respectivos vírus: sementes de feijão (Phaseolus vulgaris) com o Bean commom mosaic virus (BCMV), sementes de tomate (Solanum licopersicum) e de pimentão (Capsicum annum) contaminadas com o Tobacco mosaic virus (TMV) e de alface (Lactuca sativa) contaminadas com o Letucce mosaic virus (LMV). Considerando-se o mecanismo de transmissão do TMV, foi também desenvolvido um método para a contaminação artificial das sementes, mergulhando-se as mesmas no extrato de folhas de fumo infectadas pelo vírus, por períodos de tempo variando de 1 a 270 segundos, com posterior secagem à sombra. A sua contaminação foi confirmada pelo teste sorológico ELISA e por inoculação em plantas indicadoras. Em uma segunda etapa, foram testadas e otimizadas as técnicas biológica, sorológica (PTAS e DAS ELISA) e molecular (RT-PCR), envolvendo alguns procedimentos diferentes, para detectar cada um desses vírus nas sementes contaminadas. Para tomate e pimentão, além dos protocolos desenvolvidos, foi testada a sensibilidade dos mesmos para diagnosticar diferentes índices de infecções do TMV nas sementes. Foi possível a obtenção de sementes de pimentão e de tomate contaminadas com TMV, tanto pelo método natural como pelo artificial. As sementes de tomate e pimentão foram 100% contaminadas quando deixadas no extrato foliar contendo o vírus, a partir de um segundo de exposição. Também foram obtidas sementes de feijão contaminadas com o BCMV, mas nenhuma semente contaminada foi obtida de plantas de alface infectadas precocemente e que apresentavam sintomas bem evidentes. Isso, provavelmente, ocorreu porque os isolados utilizados não foram transmissíveis pelas sementes das cultivares empregadas. Nos testes efetuados para a diagnose de vírus nas sementes, as técnicas DAS-ELISA e RT-PCR foram capazes de detectar uma semente contaminada em um lote de 1.000 sementes (0,1%), quando feita diretamente das sementes de tomate e de pimentão, contaminadas natural e artificialmente. Do mesmo modo, no teste biológico, em que as sementes contaminadas de tomate e pimentão foram plantadas e as plântulas originadas avaliadas visualmente, não foi possível observar o aparecimento de sintomas que indicassem a infecção das plântulas pelo TMV. Isso deve ter ocorrido porque a contaminação pelo TMV é externa às sementes, de modo que nem sempre chega a infectar a planta. É provável que essas sejam contaminadas não no processo de germinação, mas no de transplante. Em plântulas de feijão, obtidas de sementes coletadas de plantas infectadas com o BCMV, o teste biológico detectou infecção em 15% delas. No teste sorológico PTAS-ELISA, foi encontrado resultado positivo em uma média de 48 das 91combinações feitas com as 1.000 sementes analisadas. Por meio da técnica RT-PCR, utilizando-se primers específicos para o BCMV, o vírus foi detectado em 6 das 30 combinações feitas com as 1.000 sementes. Apesar de o teste biológico ter sido eficiente para a detecção do BCMV em sementes de feijão, não foi adequado para a detecção de TMV em sementes de fumo e de pimentão, indicando que as técnicas sorológicas ELISA (PTAS ou DAS) e RT-PCR, utilizando sementes, são as mais recomendadas para essa finalidade.
In spite of existing indications of several techniques which can be utilized for virus diagnosis in seeds, there are no methodologies established and optimized for that purpose in the Brazilian laboratories. So, that work intended firstly to produce seeds of the following plants contaminated with the respective viruses: bean (Phaseolus vulgaris) with Bean commom mosaic virus (BCMV), tomato (Solanum licopersicum) and sweet pepper (Capsicum annum) contaminated with Tobacco mosaic virus (TMV) and lettuce (Lactuca sativa) contaminated with Letucce mosaic virus (LMV). Considering the transmission mechanism of TMV, a method for the artificial contamination of seeds was also developed, by dipping them into the tobacco leaf extract infected with the virus for time periods, varying from 1 to 270 seconds, with later shade drying. Its contamination was confirmed by the ELISA serologic test and by inoculation on indicator plants. In a second step, the biological, serologic (PTAS and DAS ELISA) and molecular (RT-PCR), techniques were tested and optimized involving some different procedures to detect each of these viruses in the contaminated seeds. For both tomato and sweet pepper, in addition to the developed protocols, the sensitivity of them to diagnose different infection indices of TMV in seeds was tested. Obtaining sweet pepper and tomato seeds contaminated by TMV both by the natural and artificial methods was possible. The tomato and sweet pepper seeds were 100% contaminated when left in the leaf extract containing the virus from 1 second´s exposition on. Also, BCMV-contaminated bean seeds were obtained, but no contaminated seed was obtained from early infected lettuce plants, which presented quite evident symptoms. That likely must have occurred because the isolates utilized were not transmissible by the seeds of the utilized cultivars. In the tests conducted for virus diagnosis on the seeds, the DAS-ELISA and RT-PCR techniques were capable of detecting one contaminated seed in a lot of 1,000 seeds (0.1%), when undertaken directly from the tomato and sweet pepper seeds, contaminated both naturally and artificially, but not from the seedlings. In the very way, in the biological test, in which the contaminated tomato and sweet pepper seeds were planted and the originated seedlings visually evaluated, it was not possible to observe the appearance of symptoms which indicated the infection. That must have occurred because the TMV-contamination is external to the seeds, so that it does not even arrive to infect the plant. It is likely that those be contaminated not in the germination process, but rather in the transplanting one. In bean seedlings obtained from seeds collected from BCMV-infected plants, the biological test detected infection in 15% of them. In the PTAS-ELISA serologic test, positive result was found on a mean of 48 out of the 91combinations out of the 1,000 analyzed seeds. Through the RT-PCR technique by utilizing primers specific to BCMV, the virus was detected in 6 out of the 30 combinations done with the 1,000 seeds. Despite of the biological test having been efficient to the detection of BCMV in bean seeds, was not adequate for TMV detection in tobacco and sweet pepper seeds, pointing out that the ELISA (PTAS or DAS) and RT-PCR serologic techniques utilizing seeds is the most recommend for that purpose.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/2727
Publicador: UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
Idioma: pt_BR
Aparece nas coleções:DFP - Agronomia/Fitopatologia - Mestrado (Dissertações)



Os itens no repositório estão protegidos por copyright, com todos os direitos reservados, salvo quando é indicado o contrário.