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metadata.teses.dc.title: Isolamento e regeneração de protoplastos de Coffea canephora a partir de suspensão de células embriogênicas
metadata.teses.dc.title.alternative: Isolation and regeneration of protoplasts from embryogenic cells suspension of Coffea canephora
metadata.teses.dc.creator: Silva, Tamires Luana
metadata.teses.dc.contributor.advisor1: Paiva, Luciano Vilela
metadata.teses.dc.contributor.advisor-co1: Mourão Filho, Francisco de Assis Alves
metadata.teses.dc.contributor.referee1: Paiva, Luciano Vilela
metadata.teses.dc.contributor.referee2: Santos, Breno Régis
metadata.teses.dc.contributor.referee3: Latado, Rodrigo Rocha
metadata.teses.dc.subject: CRISPR
Café - Melhoramento genético
Protoplastos
Soluções enzimáticas
Suspensão celular
Coffee - Genetic improvement
Protoplasts
Enzymatic solutions
Cell suspension
metadata.teses.dc.date.issued: 28-Sep-2020
metadata.teses.dc.description.sponsorship: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)
metadata.teses.dc.identifier.citation: SILVA, T. L. Isolamento e regeneração de protoplastos de Coffea canephora a partir de suspensão de células embriogênicas. 2020. 60 p. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia Vegetal) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2020.
metadata.teses.dc.description.resumo: O fruto do cafeeiro é um produto de alto valor agregado do qual é extraída uma das bebidas mais consumidas mundialmente. Seu alto custo de produção, longo ciclo de cultura e a alta demanda de mercado, atrai investimentos de empresas do setor para o melhoramento genético na busca do desenvolvimento de novos cultivares com características agronômicas desejáveis. Recentemente, a ferramenta de edição gênica CRISPR-Cas9, tem auxiliado melhoristas na geração de genótipos de interesse agronômico através da possibilidade de modificação genética sem inserção de transgenes no DNA hospedeiro, favorecendo a comercialização do cultivar obtido. Contudo, a parede celular vegetal oferece resistência mecânica para o acesso dos componentes do sistema CRISPR ao meio intracelular, sendo necessária a sua retirada das células receptoras (que passam a ser denominadas protoplastos), e posterior desestabilização da membrana plasmática. Além da aplicação da tecnologia CRISPR-Cas 9, os protoplastos também viabilizam estudos de expressão heteróloga e hibridização somática, porém a melhor maneira de explorar o potencial dos protoplastos em pesquisas, é associando-os a um protocolo eficiente de regeneração em plantas. Desta forma, este trabalho teve como objetivo a elaboração de um protocolo eficaz e reprodutível, específico para obtenção e regeneração de protoplastos de café do genótipo diploide (2n=2x=22) clone 14 de Coffea canephora, visando aplicação de tecnologia molecular de precisão para melhoramento vegetal. Para isso, suspensões de calos embriogênicos de C. canephora clone 14 foram selecionadas como material biológico, devido a sua alta capacidade de regeneração em plantas que é o principal fator limitante da técnica. A digestão enzimática da parede celular foi realizada empregando as soluções enzimáticas: 1% celulase, 0,5% driselase e 0,5% pectinase; e 0,5% celulase, 0,5% Macerozima e 0,2% pectinase, as quais apresentaram valores de rendimento e viabilidade, estatisticamente equivalentes. O valor de pH da solução enzimática também foi avaliado neste trabalho, sendo constatado que o pH 5,6 proporcionou maior eficiência enzimática e viabilidade celular simultaneamente. Em seguida, foram realizados testes para otimização da regeneração dos protoplastos, e as células plaqueadas foram submetidas à redução gradativa de pressão osmótica ao longo do cultivo celular. Após 50 dias de plaqueamento, os aglomerados celulares foram transferidos para erlenmeyers onde iniciaram-se os testes em suspensão celular empregando agitação e diferentes meios de cultivo. Também foi observado que as condições de cultivo adotadas não afetaram os aspectos físicos embriogênicos das células, propiciaram a multiplicação dos aglomerados celulares e manteve o potencial embriogênico da cultura. Finalmente, pode-se concluir que o propósito deste estudo foi alcançado com sucesso, porém é preciso que haja continuidade da pesquisa voltada a regeneração de plantas à partir da suspensão celular obtida para que seja estabelecido um protocolo de regeneração completa dos protoplastos de C. canephora em plantas, capaz de auxiliar a geração de novos genótipos-elite.
metadata.teses.dc.description.abstract: The coffee fruit is a product of high aggregate value from which one of the most consumed drinks all over the world is extracted. Its high production cost, long crop cycle and high market demand attract strong investment in the sector for crop genetic improvement that aims to develop new cultivars with desirable agronomic characteristics. Recently, the CRISPR-Cas9 gene editing tool has been helped breeders in the generation of genotypes of agronomic interest through the possibility of genetic modification without the insertion of transgenes in the host DNA, simplifying the commercialization of these specimens. Besides to the application of CRISPR-Cas 9 technology, protoplasts also enable studies of heterologous expression and somatic hybridization, but the best way to explore the potential of protoplasts in researches is to associate them with an efficient plant regeneration protocol. Thus, the current work aimed to elaborate an efficient and reproducible method specific for coffee protoplast obtention in the diploid (2n=2x=22) genotype clone 14 Coffea canephora targeting the application of precision molecular technology for plant breeding. For this, suspensions of embryogenic calluses of C. canephora clone 14 were selected as biological material, due to its high capacity of regeneration in plants, which is the principal limiting factor of the technique. Enzymatic digestion of the cell wall was performed using two different enzyme solutions: 1% cellulase, 0.5% driselase and 0.5% pectinase; and 0.5% cellulase, 0.5% Macerozyme and 0.2% pectinase, that showed similar values of performance and viability. The pH value of the enzymatic solution was also evaluated in this work, and it was found that pH 5,6 provided greater enzymatic efficiency and cell viability simultaneously. After, tests were carried out to optimize the regeneration of the protoplasts, and the plated cells were subjected to a gradual reduction in osmotic pressure throughout cell culture. After 50 days of plating, the cell pellets were transferred to erlenmeyers where the tests in cell suspension started using shaking and different means of culture. It was also observed that the cultivation conditions adopted did not affect the physical embryogenic appearance and embryogenic potential, besides favouring cell cluster multiplication. Finally, it can be concluded that the purpose of this study was successfully achieved, but it is necessary to continue research aimed at plant regeneration from the cell suspension obtained in order to establish a complete regeneration protocol for C. canephora protoplasts in plants, capable of assisting the generation of new elite genotypes.
metadata.teses.dc.identifier.uri: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/43227
metadata.teses.dc.publisher: Universidade Federal de Lavras
metadata.teses.dc.language: por
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