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Título: Estudos moleculares para expressão gênica e RNA de interferência de receptores de CO2 em Diabrotica virgifera virgifera
Título(s) alternativo(s): Molecular studies for gene expression and rna interference of co2 receptors in Diabrotica virgifera virgifera
Autor : Rodrigues, Thais Barros
Primeiro orientador: Valicente, Fernando
Primeiro membro da banca: Carneiro, Andrea Almeida
Carneiro, Newton Portilho
Grando, Magali Ferrari
Paiva, Luciano
Área de concentração: Biotecnologia Vegetal
Palavras-chave: Controle endógeno
RT-qPCR
RNAi via oral
RNAi
pRNAi
WCR
Gen de referência
Receptor gustativo
Quimioreceptor de dióxido de carbono
Silenciamento de gen
Reference genes
Housekeeping gene
Carbon dioxide chemoreceptors
Gustatory receptors
Gene silencing
Data da publicação: 2014
Agência(s) de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Referência: RODRIGUES, T. B. Estudos moleculares para expressão gênica e RNA de interferência de receptores de CO2 em Diabrotica virgifera virgifera. 2014. 104 p. (Doutorado em Biotecnologia Vegetal) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2014.
Resumo: Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae), conhecida como larva do milho ocidental (western corn rootworm - WCR), é uma das principais pragas do milho nos Estados Unidos. As larvas neonatas devem rastejar através do solo, utilizando CO2 que é liberado pela respiração das raízes das plantas, para se orientarem em direção ao seu alimento. RNAi (RNA de interferência) é um processo biológico que causa o silenciamento de moléculas de mRNA específicos e tem sido utilizado como uma ferramenta poderosa para o estudo das funções dos genes. Eventualmente, a PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR), é normalmente usado para avaliar o silenciamento do gene alvo. A precisão da interpretação dos dados de qRT-PCR depende em grande parte da seleção adequada de genes constitutivos (housekeeping genes, HKGs) que serão utilizados como genes de referência interna, porque alguns HKGs podem variar consideravelmente entre diferentes condições experimentais. A falta de tais informações em WCR torna a interpretação dos resultados de qRT-PCR difícil. Nesse trabalho, quatro algorítmos distintos (Genorm, NormFinder, BestKeeper e delta-CT), cinco candidatos a genes de referência, β-actina; GAPDH; β-tubulina; RPS9 e EF1a foram avaliados para determinar o gene de referência mais confiável sob várias condições experimentais, incluindo exposição a toxinas Bt, ao dsRNA, além de quatro diferentes tecidos e cinco estádios de desenvolvimento. Apesar de todos os genes de referência testados terem exibido expressão relativamente estável entre os diferentes tratamentos, algumas diferenças foram observadas. Verificou-se que o gene EF1a mostrou ser o mais estável para ambas exposições de toxinas de Bt e diferentes tecidos, enquanto β-actina foi considerado o melhor para diferentes estádios de desenvolvimento. Além disso, para experimentos com RNAi, RPS9 foi considerado o candidato mais estável. Estes resultados sugerem que não há um gene de referência universal adequado para todas as variáveis experimentais e que para WCR os genes de referência podem responder de forma diferente de acordo com diferentes experimentos. Análises filogenéticas foram realizadas com três genes de CO2 já conhecidos em Drosophila melanogaster e Anopheles gambiae e os dados provenientes do transcriptoma de WCR. Três genes putativos de receptores gustativos de CO2 em WCR (Dvv_Gr1, Dvv_Gr2 e Dvv_Gr3) foram identificados, além de caracterizados os perfis de expressão em quatro tecidos diferentes e cinco estádios de desenvolvimento por qRT-PCR. Em geral, o padrão de expressão de cada gene de CO2 variou entre os diferentes tecidos e estádios de desenvolvimento. Entre eles, o gene Dvv_Gr2 foi o mais expresso na cabeça e neonatas e, portanto, considerado o mais provável gene responsável pelos receptores de CO2 em WCR. Com os genes de referência estabelecidos, Dvv_Gr2 foi selecionado e testado em dois métodos de entrega de dsRNA diferentes: RNAi via oral e RNAi parental (pRNAi). Ambos os métodos de entrega do dsRNA demonstraram considerável diminuição no nível de expressão do gene Dvv_Gr2, respectivamente, em larvas do primeiro ínstar e neonatas (provenientes de fêmeas grávidas injetadas com dsGr2). Embora ensaios de comportamento deverão ser realizados, estas descobertas permitirão uma maior exploração da função de receptores específicos de CO2 em Dibrotica v. virgifera.
The western corn rootworm (WCR), Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae), is a serious pest of corn in the United States and Europe. Neonates must crawl through the soil while taking CO2 from roots as an important volatile cue to locate the roots on which they initially establish the feeding during whole larval stage. RNAi (RNA interference) is a biological process causing the silence of target mRNA molecules and has been used as a powerful tool to study the functions of genes. Eventually, the quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) is usually used to evaluate the knockdown of target gene. The accuracy of qRT-PCR data interpretation largely relies on the selection of suitable constitutive gene(s) (housekeeping genes, HKGs) as internal reference(s) because some housekeeping genes may vary considerably certain biological samples or different experimental conditions. Lack of such information in WCR makes the interpretation of qRT-PCR results difficult. Here, with four distinct algorithms (Genorm, Normfinder, Bestkeeper and Delta CT), five candidate reference HKGs β-actin; GAPDH; β-tubulin; RPS9 and EF1a from WCR transcriptome database were evaluated to determine the most reliable reference HKG under various experimental conditions, including exposure to dsRNA and Bt toxins, as well as four different tissues and five developmental stages. Although all the reference HKGs tested exhibited relatively stable expression among the different treatments, some differences were still noted. It was found that EF1a gene was appeared to be the most stable reference HKG for both Bt exposures and different tissue experiments while β-actin was considered the best one in experiments involving different life stages. In addition, for RNAi experiments, the RPS9 was performed as a good candidate with highest stability in expression. These results suggest that there is no single reference gene suitable for all comparisons and for WCR, reference genes can respond differently to different experiments. With three known CO2 genes from Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae as query, we identified three putative WCR CO2 Gr genes (Dvv_Gr1, Dvv_Gr2, and Dvv_Gr3) from our WCR transcriptome database and further characterized their expression profiles in four different tissues and five developmental stages by qRT-PCR. The phylogenetic analysis showed that all three candidate Dvv_Gr genes were well cluster into different group with their countpartner from D. melanogaster and An. gambiae. In general, the expression pattern of each CO2 gene varies among the different tissues and development stages. Among them, the Dvv_Gr2 gene was found to be mostly expressed in head and neonate and considered as most likely gene as CO2 receptor in WCR. Futher, with reference HKGs established, the Dvv_Gr2 gene was primarily chosen and tested for the establishment of two different dsRNA delivery methods, RNAi orally and parental RNAi (pRNAi). The RNAi by feeding and pRNAi showed considerable level of knockdown of Dvv_Gr2 gene in 1st instar larvae and the offspring (1st instar larvae of adult female receiving dsRNA of Dvv_Gr2), respectively. Although behavior assays will need to be performed, these finding will allow exploration of the functional role of specific CO2 receptors in Dibrotica v. virgifera.
metadata.teses.dc.description: Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós- Graduação em Biotecnologia Vegetal, área de concentração em Biotecnologia Vegetal, para a obtenção do título de Doutor.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/4606
Publicador: UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
Idioma: pt_BR
Aparece nas coleções:PPBV - Biotecnologia Vegetal - Doutorado (Teses)



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