Embriogênese somática e validação do sistema CRISPR/CAS9 em Coffea canephora
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Universidade Federal de Lavras
Faculdade, Instituto ou Escola
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Não se aplica
Programa de Pós-Graduação
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal
Agência de fomento
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Tipo de impacto
Áreas Temáticas da Extenção
Objetivos do desesenvolvimento sustentável
Dados abertos
Resumo
Coffea canephora é a segunda espécie mais cultivada do gênero Coffea, representando
cerca de 25% da produção brasileira e sendo especialmente utilizada na indústria do café
solúvel e em blends com Coffea arabica. A espécie apresenta alta variabilidade genética,
tendo os programas de melhoramento buscado a identificação, seleção e propagação de
genótipos com características superiores. Entretanto o melhoramento convencional
demanda muito tempo e a aplicação de ferramentas biotecnológicas pode ajudar a acelerar
este processo. Dessa forma, os objetivos deste trabalho foram testar diferentes protocolos de
indução de embriogênese somática (ES) direta para C. canephora visando a sua aplicação
em trabalhos futuros de transformação genética, a validação da aplicação de uma estratégia
multiplex do sistema CRISPR/Cas9 através do silenciamento do gene CcPDS, e a obtenção
de plantas com redução do teor de cafeína através do silenciamento, via CRISPR/Cas9, dos
genes das enzimas de biossíntese da cafeína: xantosina metiltransferase (XMT), 7-
metilxantina metiltransferase (MXMT) e 3,7-dimetilxantina metiltransferase (DXMT).
Para a avaliação da indução de ES direta foram utilizados explantes provenientes de folhas
de plântulas in vitro e de folhas de plantas de casa de vegetação de C. canephora clone 22,
submetidos a três diferentes tratamentos de indução. O mais eficiente para indução de ES
direta foi o Meio 3, com 96,25% de eficiência de indução e média de 34 embriões por
explante de folhas in vitro e 67% de eficiência de indução e média de 67 embriões por
explante de casa de vegetação. Em ambos experimentos de edição genômica, foram
utilizados calos embriogênicos de C. canephora clone 14 e diferentes construções gênicas
multiplex, nas quais os sgRNAs estavam sob a regulação de promotores U6 de C.
canephora ou Arabidopisis thaliana. Plântulas e embriões apresentando os fenótipos albino,
variegado e verde foram obtidas na transformação com as construções contendo sgRNAs
para o gene CcPDS, sendo que 71,4% das plantas avaliadas apresentaram algum tipo de
mutação, a maioria em homozigose. Seis plantas possivelmente transformadas para o
silenciamento dos genes de síntese de cafeína foram analisadas e cinco estavam
efetivamente transformadas. Destas, apenas uma apresentou mutações nas regiões
reconhecidas pelos sgRNAs, sendo uma mutação em heterozigose no segundo alvo do gene
XMT, uma mutação também em heterozigose nos dois alvos do gene DXMT e nenhuma
mutação observada no gene MXMT. Com os resultados obtidos, é possível concluir que a
ES direta é uma estratégia muito mais rápida de regeneração de embriões de cafeeiro e o
genótipo parece ter forte influência no sucesso de estratégias de silenciamento gênico em C.
canephora, assim como os genes a serem silenciados, que podem afetar o desenvolvimento
das plantas editadas.
Abstract
Coffea canephora is the second most cultivated species of the genus Coffea,
representing about 25% of the Brazilian production. It is used especially in the soluble
coffee industry and in blends with C. arabica. Due to its high genetic variability,
breeding programs have sought to identify, select, and propagate superior genotypes.
However, conventional breeding takes a lot of time and the use of biotechnological
tools can help to speed up this process. Thus, this study aimed to test different protocols
for direct somatic embryogenesis induction of C. canephora aiming its application in
future genetic transformation studies, the validation of the application of a multiplex
strategy of the CRISPR-Cas9 system by silencing the CcPDS gene and obtaining plants
with reduced caffeine content through silencing via CRISPR-Cas9 of the genes XMT,
MXMT, and DXMT of the caffeine biosynthesis enzymes. To test the induction of
direct embryogenesis, explants from in vitro leaves and leaves from the greenhouse of
C. canephora clone 22 were used, submitted to three different induction treatments.
Medium 3 was the most efficient, with 96.25% induction efficiency and an average of
33.99 embryos per greenhouse explant and 67% induction efficiency and an average of
66.93 embryos per in vitro leaf explant. For genome editing experiments, embryogenic
calluses from C. canephora clone 14 were used and different multiplex gene cassettes,
in which sgRNAs were under the regulation of U6 promoters from C. canephora and
Arabidopsis thaliana. Plants and embryos showing the albino, variegated and green
phenotypes were obtained by the transformation with the cassettes containing sgRNAs
for the CcPDS gene, mutations were observed in 71.4% of the analyzed plants, most of
them were homozygous. Six plants possibly mutated for caffeine synthesis were
analyzed and five were effectively transformed. Of these, only one showed a mutation
in the regions recognized by the sgRNAs, heterozygous mutations in the second target
of the XMT gene, and a mutation also is heterozygous in the two targets of the DXMT
gene. No mutations were observed in the MXMT gene. With these results, it is possible
to conclude that direct embryogenesis is a much faster strategy for regenerating coffee
embryos and the genotype seems to have a strong influence on the success of gene
silencing strategies in C. canephora, as well as the genes to be silenced, which can affect
the development of edited plans.
Descrição
Área de concentração
Agência de desenvolvimento
Palavra chave
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Objetivo
Procedência
Impacto da pesquisa
Resumen
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DOI
Citação
CASARIN, T. Embriogênese somática e validação do sistema CRISPR/CAS9 em Coffea canephora. 2020. 100 p. Tese (Doutorado em Biotecnologia Vegetal) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2020.