dissertação
Avaliação de marcas epigenéticas com a análise da expressão gênica de rDNA 45S em Urochloa ruziziensis, Urochloa brizantha e seu híbrido
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Editor
Universidade Federal de Lavras
Faculdade, Instituto ou Escola
Departamento
Departamento de Biologia
Programa de Pós-Graduação
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas
Agência de fomento
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Tipo de impacto
Áreas Temáticas da Extenção
Objetivos de Desenvolvimento Sustentável
Dados abertos
Resumo
O gênero Urochloa P. Beauv. (incluindo Brachiaria (Trin.) Griseb.) apresenta um papel de
destaque no cenário agropecuário brasileiro sendo composto por espécies com diferentes
níveis de ploidia e modo de reprodução. Estudos sobre a relação genômica dentro desse
gênero são escassos, assim como os estudos envolvendo marcas epigenéticas, diretamente
envolvidas com a organização do genoma. O objetivo deste trabalho foi identificar o padrão
da metilação nas citosinas (5-mCyt), relacionada ao silenciamento gênico, e da dimetilação da
lisina 9 na histona H3 (H3K9me2), associada a estrutura heterocromática, nas diferentes
conformações dos sítios de rDNA 45S, nos núcleos interfásicos e associar esses resultados
com a análise da expressão gênica em Urochloa ruziziensis (genoma B
2
B
2
B
2
B
2
), Urochloa
brizantha cv. Marandu (genoma BBB
1
B
1
) e respectivo híbrido interespecífico- H1863
(genoma BB
1
B
2
B
2
). As técnicas de imunomarcação foram realizadas em combinação com a
FISH (hibridização in situ fluorescente) para a localização dos sítios de rDNA 45S. As
lâminas foram feitas com células meristemáticas, obtidas de pontas de raízes fixadas em
Carnoy (etanol:ácido acético, 3:1). A imunodetecção indireta foi realizada com os anticorpos
primários anti-H3K9me2 mouse monoclonal e anti-5-metil-citosina mouse monoclonal. Estes
foram detectados com anticorpo secundário mouse policlonal TRITC-conjugado. A FISH foi
realizada logo após à imunomarcação, utilizando sondas de rDNA obtidas de Triticum
aestivum L.. A partir da combinação destas duas técnicas pôde-se perceber uma relação direta
entre as marcas epigenéticas e as diferentes conformações das regiões organizadoras do
nucléolo (RONs). Foram observados predominantemente sítios intra e perinucleolares que,
em sua maioria, estavam hipometilados e/ou hiper/hipometilados, descondensados ou
parcialmente condensados. Análise da expressão gênica foi realizada de forma qualitativa
através da PCR convencional utilizando DNA complementar (cDNA) e confirmada por meio
da técnica RT-qPCR, utilizando primers desenhados para a região ITS-1 de U. brizantha e U.
ruziziensis. As análises moleculares mostraram uma expressão diferencial entre os sítios de
rDNA 45S dos diferentes genitores dentro do genoma do híbrido 1863, caracterizando um
cenário de dominância nucleolar, onde ocorre a expressão preferencial do genes de rDNA 45S
herdados de U. brizantha, enquanto os sítios provenientes de U. ruziziensis são silenciados
através de mecanismos epigenéticos. Estes resultados permitiram inferir que os sítios que se
encontravam hipermetilados na citosina e H3k9m2, foram herdados de U. ruziziensis,
enquanto que a porção de rDNA caracterizada pela hipometilação da citosina e da H3k9me2 é
originada de U. brizantha.
Abstract
The genus Urochloa P. Beauv. (including Brachiaria (Grin.) Griseb.) has a prominent role in
the Brazilian agricultural scenario, being composed of species with different levels of ploidy
and reproduction’s types. Studies on the genomic relationship within this genus are rare, as
the researches involving epigenetic marks, directly involved with the genome organization.
The aim of this work was to identify the pattern of cytosine methylation (5-mCyt) related to
gene silencing and the dimethylation of lysine 9 in histone H3 (H3K9me2), associated with
the heterochromatic structure, in the different conformations of the 45S rDNA sites, in the
interphase nuclei and to associate these results with the analysis of the gene expression in
Urochloa ruziziensis (genome B
2
B
2
B
2
B
2
), Urochloa brizantha cv. Marandu (genome
BBB
1
B
1
) and its interspecific hybrid – H1863 (genome BB
1
B
2
B
2
). Immunostaining
techniques were performed in combination with FISH (fluorescence in situ hybridization) for
the localization of the 45S rDNA sites. The slides were made with meristematic cells obtained
from the root tips fixed in Carnoy (ethanol:acetic acid, 3:1 v/v). The indirect immunodetection
was performed with the primary antibodies anti-H3K9me2 mouse monoclonal and anti-5-methyl cytosine mouse monoclonal. The detection was done using secondary antibodies
mouse polyclonal TRITC-conjugated. FISH Technique was performed sequentially on
immunostaining using rDNA probes obtained from Triticum aestivum L. From the
combination of these two techniques it was possible to perceive a direct relation between the
epigenetic marks and the different conformations of the nucleolar organizing regions (NORs).
It was noticed predominantly intra and perinucleolar sites, which were mostly
hypomethylated and/or hyper/hypomethylated, decondensed or partially condensed. Gene
expression analysis was performed qualitatively through conventional PCR using
complementary DNA (cDNA) and it was confirmed by the RT-qPCR technique, using
primers designed for the ITS-1 region of U. brizantha and U. ruziziensis. The molecular
analyzes showed differential expression between the 45S rDNA sites of the different genomes
within the genome of hybrid 1863, characterizing a scenario of nucleolar dominance, in which
happens the preferential expression of the 45S rDNA genes inherited from U. Brizantha,
while the sites from U. ruziziensis are silenced through epigenetic mechanisms. These results
allowed to infer that those sites that were hypermethylated in cytosine and H3k9me2 marks
were inherited from U. ruziziensis, whereas the portion of rDNA characterized by
hypomethylation of cytosine and H3k9me2 was originated from U. brizantha.
Descrição
Área de concentração
Agência de desenvolvimento
Palavra chave
Marca
Objetivo
Procedência
Impacto da pesquisa
Resumen
ISBN
DOI
Citação
SANTOS, Y. D. Avaliação de marcas epigenéticas com a análise da expressão gênica de rDNA 45S em Urochloa ruziziensis, Urochloa brizantha e seu híbrido. 2018. 52 p. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2018.