Monitoring Clavibacter michiganensis SUBSP. michiganensis GFP – marked strain inoculated in tomato seeds

Abstract

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) é a bactéria causadora da murcha e cancro bacteriano do tomateiro, a mais importante doença transmitida por sementes. Para estudos sobre colonização, transmissão e avaliação de métodos de diagnose de Cmm em sementes, existe a necessidade de infecções internas, como qual se é observado em infecções que ocorrem naturalmente. Neste estudo, um procedimento foi desenvolvido para gerar sementes de tomate internamente infectadas com Cmm. Estas sementes podem ser utilizadas em avaliações de métodos para detecção em extratos de sementes, para estudo do efeito do tratamento de sementes e para o estudo na transmissão de sementes para mudas. Para tal, sementes de tomate foram feridas por escarificação, amolecidas pela incubação em blotters umedecidos e inoculadas com a suspensão de um isolado de Cmm naturalmente resistente a Rifampicina por infiltração a vácuo. Um isolado de Cmm marcado com GFP foi utilizado para a visualização de Cmm in planta. A dinâmica populacional (interna e externa) de Cmm em sementes e mudas de tomate foi estudada por plaqueamento, por um sistema de monitoramento não invasivo para bactérias marcadas com GFP em planta (PathoScreen), por Microscopia de escaneamento com laser confocal (CLSM), Microscopia de epifluorescência (ESM) e um ensaio com TaqMan. Sementes mortas e viáveis foram utilizadas para a observação do comportamento de Cmm em diferentes tecidos. Para estimular o crescimento de Cmm nas sementes, estas foram incubadas em blotters umedecidos ou em um meio/solução nutriente semi-seletivo para Cmm. Imediatamente após a inoculação, algumas células de Cmm puderam ser observadas dentro das sementes e a incubação dessas sementes resultou em um grande aumento desta população. Este aumento da densidade populacional dentro da semente foi confirmado com o monitoramento do sinal de GFP por análises de PathoScreen. Sementes inteiras e cortadas transversalmente analisadas com CLSM e ESM indicaram que durante a incubação, Cmm coloniza os tricomas, as camadas exteriores do tegumento, o endosperma e o embrião. O sinal de GFP também pôde ser observado por ESM na capa de sementes germinadas, cotilédones, caule e raiz. Colonização dos vasos do xilema no caule e raiz das mudas foi observada com CLSM, indicando infecção sistêmica de sementes germinadas. A prévia incubação de sementes infectadas em um meio semi-seletivo aperfeiçoou a detecção de Cmm por TaqMan. Este enriquecimento foi obtido pelo aumento da baixa densidade populacional de Cmm nas sementes de tomate.