dissertação
Otimização de parâmetros de transformação genética e criopreservação de Eucalyptus grandis X Eucalyptus urophylla
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Editor
Universidade Federal de Lavras
Faculdade, Instituto ou Escola
Escola de Ciências Agrárias de Lavras (ESAL)
Departamento
Departamento de Biologia (DBI)
Programa de Pós-Graduação
Programa de Pós-Graduação em Agronomia/Fisiologia Vegetal
Agência de fomento
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)
Tipo de impacto
Áreas Temáticas da Extensão
Objetivos de Desenvolvimento Sustentável
Dados abertos
Resumo
O objetivo do trabalho foi estabelecer parâmetros de transformação genética para
o híbrido Eucalyptus grandis X Eucalyptus urophylla, mediado por
Agrobacterium tumefaciens, bem como realizar a criopreservação de ápices
caulinares para o mesmo híbrido, visando seu armazenamento e sua conservação.
Os calos organogênicos deste híbrido foram submetidos a diferentes processos de
transformação, infiltração a vácuo (4 e 8 minutos com pressão de 400 mmHg),
sonicação (15 e 30 segundos a uma frequência de 40 kHz), os tratamentos foram
aplicados de forma combinada e isolada. Paralelamente, foram avaliados três
concentrações de acetoseringona (100 µM, 200 µM e 300 µM) e três temperaturas
de co-cultivo (19 ºC, 22 ºC e 25 ºC). Dentre os parâmetros estudados, a maior
média da expressão transiente foi obtida quando se utilizou o método de infecção
por infiltração a vácuo durante 4 minutos com média de expressão transiente da
atividade do GUS (4,4), a adição de 100 μM de acetoseringona com média de
expressão transiente (0,76), e o co-cultivo sob temperatura de 19 ºC com maior
média de expressão transiente (2,6). Para o processo de criopreservação foi
determinado o meio de cultura para a regeneração dos ápices, testando diferentes
concentrações de BAP (0,14 µM; 1,42 µM) e BAP (0,14 µM) em combinação
com AIA (5,10 µM), após 30 dias avaliou-se percentagem de regeneração de
plantas, formação de calos e plantas hiper-hídricas. Para a criopreservação
realizou-se o pré-cultivo dos ápices em meio MS suplementado com sacarose a
0,2 M por 24 horas e sacarose 0,5 M por mais 24 horas e foram avaliados seis
tempos de exposição ao PVS2 (20, 40, 60, 80, 100 e 120 minutos) e posterior
imersão em nitrogênio líquido. Após 30 dias avaliou-se percentagem de
sobrevivência e após 60 dias percentagem de regeneração dos ápices. As
observações histológicas e ultra-estruturais dos ápices foram realizadas em
diferentes fases do processo de criopreservação e após uma semana de
recuperação. As variáveis analisadas foram plasmólise, danos celulares, núcleos
pinóticos e ruptura de membrana. Para avaliação da percentagem de plasmólise
foram realizadas medições da área da parede celular e do citoplasma em três
camadas dos ápices caulinares (L1; L1 -L3; L7-L9), utilizando o software imagePro Plus®. A concentração de 0,14 µM de BAP promoveu melhores taxas de
regeneração (80%) sem presença de plantas hiper-hídricas. A criopreservação foi
bem sucedida quando os ápices foram expostos ao crioprotetor por 60 minutos de
PVS2, com maiores taxas de regeneração (66%), proporcionando uma maior
integridade celular, sem a presença de núcleos pinóticos, com baixas taxas de
plasmólise.
Abstract
This study aimed was to establish genetic transformation parameters for the
hybrid Eucalyptus grandis X Eucalyptus urophylla, mediated by Agrobacterium
tumefaciens as well as perform the cryopreservation of shoot tips for the same
hybrid, aiming storage and conservation. The organogenic hybrid calluses were
subjected to different transformation process, vacuum infiltration (4 to 8 minutes
at 400 mmHg), sonication (15 and 30 seconds at a frequency of 40 kHz),
combined and isolation. At the same time, were evaluated three concentrations of
acetosyringone (100 μM, 200 μM and 300 μM) and three temperatures of cocultivation (19° C, 22° C and 25° C). Among the studied parameters, the mean
value of the transient expression was obtained when using the infection method
by vacuum infiltration for 4 minutes with mean transient expression of GUS
activity (4,4), the addition of 100μM of acetosyringone mean transient expression
(0.76), and co-cultivation at a temperature of 19° C with higher average transient
expression (2.6). For the cryopreservation process was pre-determined
regeneration medium of shoot tips using different concentrations of BAP (0,14
μM; 1,42 μM) and BAP (0,14 μM) in combination with IAA (5,10 μM), after 30
days it was evaluated the percentage of plant regeneration, calluses formation and
vitrified plants. To cryopreservation was performed pre-cultivation of shoot tips
on MS medium supplemented with 0.2 M sucrose for 24 hours and 0.5 M sucrose
for 24 hours and were evaluated six times of exposure to PVS2 (20, 40, 60, 80,
100 and 120 minutes) and subsequent immersion in liquid nitrogen, after 30 days
it was evaluated percent survival and after 60 days it was evaluated the percentage
of shoots. Histological and ultrastructural observations of the apices were made
in different stages of the cryopreservation process, and after one week of recovery,
through light and scanning microscopy, of which measurements were made using
plasmolysis image-Pro Plus software. The concentration of BAP 0,14 μM best
promoted regeneration rates (80%) without the presence of vitrified plants.
Cryopreservation was successful using 0.2 M and 0.5 M sucrose in the precultivation and exposure to a cryoprotectant for 60 minutes, providing no
irreversible damage cells, resulting in higher survival rates (66%). The
histopathological and ultrastructural analysis of the shoot tips were made during
the cryopreservation process for the treatment of exposure for 60 minutes was
found to increased cell integrity without the presence of picnotics nucleus with
low plasmolysis rates when compared with treatments exposed to longer times
(80 and 120 minutes) to the PVS2.
Descrição
Área de concentração
Linha de pesquisa
Agência de desenvolvimento
Palavra chave
Marca
Objetivo
Procedência
Impacto da pesquisa
Resumen
Palavras-chave
ISBN
DOI
Citação
VAZ, C. F. Otimização de parâmetros de transformação genética e
criopreservação de Eucalyptus grandis X Eucalyptus urophylla. 2016. 112 p. Dissertação (Mestrado em Fisiologia Vegetal)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2016.