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Título: Resposta adaptativa de Clostriduim perfrigens, Salmonella Enteritidis e Staphylococcus aureus aos óleos essenciais de Syzygium aromaticum, Origanum vulgare, eugenol, timol e ácido peracético
Título(s) alternativo(s): Adaptive response of Clostridium perfringens, Salmonella Enteritidis and Staphylococcus aureus to Syzygium aromaticum and Origanum vulgare essential oils, eugenol, thymol, and peracetic acid
Autor : Coelho, Mariana Silva
Primeiro orientador: Piccoli, Roberta Hilsdorf
Primeiro membro da banca: Benevenuto, Wellingta Cristina Almeida do N.
Cardoso, Patrícia Gomes
Tebaldi, Victor Maximiliano Reis
Área de concentração: Microbiologia Agrícola
Palavras-chave: Cravo-da-índia
Orégano
Bactéria - Resistência
Clove
Bacterial - Resistance
Data da publicação: 2014
Agência(s) de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Referência: COELHO, M. S. Resposta adaptativa de Clostriduim perfrigens, Salmonella Enteritidis e Staphylococcus aureus aos óleos essenciais de Syzygium aromaticum, Origanum vulgare, eugenol, timol e ácido peracético. 2014. 95 p. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Agrícola) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2014.
Resumo: The provision of safe and healthy food is of great interest to government and to food industry. To guarantee food safety, antimicrobial agents, sanitizers as well as preservatives are increasingly being used. This way, microorganisms are increasingly exposed to these substances, which often do not eliminate them, but often promotes selective pressure leading to the emergence of resistant microorganisms to them, or by activating the mechanisms of adaptive response to stress, causing them to survive in inhospitable environments. This study aimed to evaluate the adaptive response and cross-adaptation of Clostridium perfringens, Salmonella enterica Enteritidis and Staphylococcus aureus to sublethal concentrations of Origanum vulgare (oregano) essential oils (EO's) and of Syzygium aromaticum (clove),to the majority compounds eugenol and thymol and to peracetic acid disinfectant. The minimum bactericidal concentrations (MBC) and the antimicrobial effect of the temperature cultivation on them were determined employing the broth dilution technique, using Brain Heart Infusion broth (BHI). The temperatures used were 20 ºC, 30 ºC and 37 ºC, the incubation time was 24 hours. The antimicrobial agents were homogenized in BHI broth containing 0.5% (v/v) Tween 80 The tested concentrations were 0.00.; 0.05; 0.09; 0.19; 0.39; 0.78; 1.56, 3.12 and 6.25% (v/v). After incubation, aliquots of the cultures were taken and plated on BHI agar, supplemented with 0.5% glucose, plates were incubated at 37 ° C for 24 hours. The MBC was determined based on the lack of growth on the plates. To evaluate the adaptive response after activation of culture, aliquots were transferred to tubes containing sublethal concentrations (1/4 MIC and 1/8 MIC) of antimicrobial agents and cultured at 37 ° C for 6 hours. After this period, the cells were recovered and MBC was again determinate again. The study of cross-adaptation was conducted by cultivating Clostridium perfringens in the presence of sublethal concentrations of eugenol, thymol and peracetic acid at 37 ° C for 6h. After adjustment, the recovered cells were used to determine the MBC of the compounds to which they have not previously been exposed to in media containing different pH (6.0, 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, 3.5, 3.0) and cultivation temperature of 20 ºC. For S. aureus e S. Enteritidis the influence of temperature on the minimum inhibitory concentration (MIC) and bactericidal (MBC) of EOs, eugenol, thymol and peracetic acid was studied using the technique of broth microdilution. Antibacterial agents were used in concentrations of 0.00; 0.05; 0.09; 0.19; 0.39; 0.78; 1.56, 3.12 and 6.25 (v/v) and temperatures were studied 20; 30 and 37 ° C. In all experiments, the EOs, thymol and eugenol were homogenized in brain heart infusion broth (BHI), supplemented with 0.5% (v/v) of Tween 80. In all studies involving peracetic acid the tween 80 was not used. Bacterial growth was checked by reading the absorbance (DO620nm) after incubation of the cultures at different temperatures for 24 hours. To evaluate the adaptive response, microorganisms were exposed to sublethal concentrations of 1/4 MIC and 1/8 MIC of antibacterial for 6 hours and then incubated at 37 ° C for 24 hours in concentrations above the MIC. The ability to cross adaptation of S. aureus and S. enteritidis has been previously studied by culturing the cells for 6h in the presence of thymol and carvacrol or peracetic acid in sub-lethal concentrations (1/4 and 1/8 MIC). After cultivation, cells were recovered and exposed to different antimicrobials of those exposed to sublethal concentrations, temperature of 20 ° C and different pH (6.0, 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, 3.5, 3.0) adjusted with lactic acid. For C. perfringens there was no influence of cultivation temperature on the MBC of the essential oils of clove and oregano and thymol compound whose MBC were 6.25; 1.56 and 0.78%. However at 30 ºC, the MBC of eugenol and peracetic acid were double (6.25%) and half (0.06%), respectively, than those obtained in the other temperatures. After exposure to sublethal concentrations of the antimicrobial at 37 ºC, C. perfringens was more sensitive to the thymol and eugenol, not growing in media containing these antibiotics half of the MBC. However, there was adaptation to EO and to peracetic acid, once at concentrations of 0.24% and 11.25%, respectively, C. perfringens grew. In cultivation temperature of 20 ºC there was cross adaptation of C. perfringens to all antibiotics tested. Only exposed to 1/8 cells of eugenol MBC were able to adapt to greater pH than the minimal growth one. C. perfringens showed capacity of adaptation and cross-adaptation to some stress factors studied, a fact that shows the risk of food poisoning. MICs of EOs of oregano and clove, thymol, eugenol and peracetic acid were to S. Enteritidis, respectively 0.39; 0.39; 0.09; 0.39 and 0.03%. For S. aureus they were, respectively, 0.78, 0.78; 0.39; 1.56 and 0.06%. The MIC of eugenol and EO were higher at 37 ºC for S. aureus than at 20 ºC and 30 ºC. As for S. Enteritidis, the MIC of both OE clove (0.39%) and for eugenol (0.39%) were higher at 37 ºC, at this temperature the MIC of peracetic acid, 0.03%, was lower. Thymol MIC was only influenced by the temperature of 30 ºC, which was higher than the others (0.19%). Both S. aureus as S. Enteritidis, adapted, were more sensitive to the previously determined MICs, however, high variability was observed in the growth of treated cells when grown in higher concentrations than the MIC. Similarly, variability in the physiological response of the cells of both S. aureus and S. enteritidis was observed in the cross adaptation. S. aureus has been shown to tolerate lower pH after exposure to sublethal concentrations of eugenol, thymol and peracetic acid, fact that was not observed with Salmonella. The bacteria studied were capable of adapting to conditions prior to the inadequate growth when exposed to sublethal conditions indicating risk in getting safe food.
A oferta de alimentos seguros e saudáveis é de grande interesse por parte governamental e indústria de alimentos. Para a garantia da inocuidade dos alimentos, cada vez mais se utilizam de agentes antimicrobianos, tanto como conservantes quanto sanificantes. Assim os microrganismos ficam cada vez mais expostos a essas substâncias as quais muitas vezes não os eliminam, promovendo muitas vezes pressão seletiva levando ao aparecimento de microrganismos resistentes a eles, ou ativando seus mecanismos de resposta adaptativa ao estresse, fazendo com que sobrevivam em condições ambientais inóspitas. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resposta adaptativa e a adaptação cruzada de Clostridium perfringens, Salmonella enterica Enteritidis e Staphylococcus aureus à concentrações subletais dos óleos essenciais (OE’s) de Origanum vulgare (orégano) e Syzygium aromaticum (cravo-da-índia), aos compostos majoritários eugenol e timol e ao desinfetante ácido peracético. As concentrações mínimas bactericidas (CMB) dos antimicrobianos e a influência da temperatura de cultivo sobre C. perfringens foram determinadas empregando-se a técnica de diluição em caldo, utilizando-se caldo Brain Heart Infusion (BHI). As temperaturas empregadas foram: 20 °C, 30 °C e 37°C, o tempo de incubação foi de 24 horas. Os antimicrobianos foram homogeneizados em caldo BHI contendo 0,5% (v/v) de Tween 80. As concentrações testadas foram de 0,00; 0,05; 0,09; 0,19; 0,39; 0,78; 1,56; 3,12 e 6,25% (v/v). Após incubação, alíquotas das culturas foram retiradas e plaqueadas em ágar BHI adicionado de 0,5% de glicose, as placas foram incubadas à 37°C por 24 horas. A CMB foi determinada baseando-se na ausência de crescimento nas placas. Para avaliação da resposta adaptativa, após ativação da cultura, alíquotas foram transferidas para tubos contendo concentrações subletais (1/4 CMI e 1/8 CMI) dos antimicrobianos e cultivados a 37 °C por 6 horas. Após esse período, as células foram recuperadas e as CMB foram novamente determinadas. O estudo da adaptação cruzada foi realizado cultivando Clostridium perfringens em presença de concentrações subletais de eugenol, timol e ácido peracético a 37 °C por 6h. Após adaptação, as células recuperadas foram utilizadas para determinação das CMB dos compostos aos quais elas não foram previamente expostas, em meio contendo diferentes pH (6,0; 5,5; 5,0; 4,5; 4,0; 3,5; 3,0) e a temperatura de cultivo de 20°C. Para S. aureus e S. Enteritidis a influência da temperatura sobre a concentração mínima inibitória (CMI) e bactericida (CMB) dos OEs, eugenol, timol e ácido peracético foi estudada empregando-se a técnica de microdiluição em caldo. Os antibacterianos foram utilizados nas concentrações de 0,00; 0,05; 0,09; 0,19; 0,39; 0,78; 1,56; 3,12 e 6,25 (v/v) e as temperaturas estudas foram 20; 30 e 37°C. Em todos os experimentos, os OEs, o timol e eugenol foram homogeneizados em caldo Brain Heart Infusion (BHI) adicionado de 0,5% (v/v) de Tween 80. Em todos os estudos envolvendo ácido peracético o Tween 80 não foi utilizado. O crescimento bacteriano foi verificado pela leitura da absorbância (DO620nm) após incubação das culturas nas diferentes temperaturas por 24h. Para avaliação da resposta adaptativa, os microrganismos foram expostos às concentrações subletais de 1/4 CMI e 1/8 CMI dos antibacterianos por 6 horas e posteriormente incubados a 37 °C por 24 horas em concentrações acima das CMI. A capacidade de adaptação cruzada de S. aureus e S. Enteritidis foi estudada cultivando previamente as células por 6h em presença de timol, carvacrol e, ou, ácido peracético em concentrações subletais (1/4 e 1/8 do CMI). Após cultivo, as células foram recuperadas e expostas a agentes antimicrobianos diferentes daqueles expostos a concentrações subletais, a temperatura de 20°C e a diferentes pH (6,0; 5,5; 5,0; 4,5; 4,0; 3,5; 3,0). Para C. perfingens não houve influência da temperatura de cultivo sobre a CMB dos óleos essenciais de cravo e orégano e do composto timol, cujas CMB foram de 6,25; 1,56 e 0,78%. Entretanto a 30°C as CMB do eugenol e ácido peracético foram o dobro (6,25%) e a metade (0,06%), respectivamente, daquelas obtidas nas outras temperaturas. Após exposição às concentrações subletais dos antimicrobianos a 37°C, C. perfringens se mostrou mais sensível ao timol e ao eugenol, não crescendo em meio contendo metade da CMB desses antimicrobianos. Entretanto, observou-se adaptação ao OE de cravo e ao ácido peracético, uma vez que, nas concentrações de 11,25% e 0,24%, respectivamente, C. perfringens cresceu. Na temperatura de cultivo de 20°C houve adaptação cruzada de C. perfringens a todos os antimicrobianos testados. Apenas as células expostas a 1/8 da CMB de eugenol foram capazes de se adaptarem ao pH maior que o mínimo de crescimento. C. perfringens apresentou capacidade de adaptação e adaptação cruzada a alguns fatores de estresse estudados, fato que mostra o risco de ocorrência de toxinfecções alimentares. As CMI dos OEs de orégano e cravo da índia, timol, eugenol e ácido peracético foram para S. Enteritidis, respectivamente de 0,39; 0,39; 0,09; 0,39 e 0,03%. Já para S. aureus foram, respectivamente, 0,78;, 0,78; 0,39; 1,56 e 0,06%. As CMI dos OE e do eugenol foram maiores a 37°C par S. aureus do que a 20 e 30°C. Já para S. Enteritidis, as CMI tanto do OE de cravo da índia (0,39%) quanto para o eugenol (0,39%) foram maiores a 37°C, nesta temperatura a CMI do ácido peracético, 0,03%, foi menor. A CMI do timol foi influenciada apenas pela temperatura de 30°C, onde foi maior que as outras (0,19%). Tanto S. aureus quanto S. Enteritidis, adaptadas, se mostraram mais sensíveis as CMIs anteriormente determinadas, entretanto foi observada alta variabilidade no crescimento das células expostas quando cultivadas em concentrações mais elevadas que a CMI. Da mesma forma, a variabilidade na resposta fisiológica das células tanto de S. aureus quanto de S. Enteritidis, foram observadas na adaptação cruzada. S. aureus se mostrou capaz de tolerar pH mais baixos após exposição a concentrações subletais de eugenol, timol e ácido peracético, fato não observado com Salmonella. As bactérias estudadas mostraram-se capazes de se adaptarem a condições antes inadequadas ao seu crescimento quando expostas a condições subletais indicando risco na obtenção de alimentos seguros.
metadata.teses.dc.description: Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, área de concentração Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de Mestre.
URI: http://repositorio.ufla.br/jspui/handle/1/3690
Publicador: UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
Idioma: pt_BR
Aparece nas coleções:DBI - Microbiologia Agrícola - Mestrado (Dissertações)



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