tese
Caracterização genética de isolados do Squash mosaic virus (SqMV) e análise de imagens para avaliação da qualidade fisiológica de sementes produzidas por plantas de abóbora infectadas
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Universidade Federal de Lavras
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Escola de Ciências Agrárias de Lavras ( ESAL)
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Departamento de Fitopatologia
Programa de Pós-Graduação
Departamento de Fitopatologia
Agência de fomento
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Tipo de impacto
Áreas Temáticas da Extenção
Objetivos de Desenvolvimento Sustentável
Dados abertos
Resumo
O Squash mosaic virus (SqMV) infecta plantas da família das cucurbitáceas, estando associado a perdas consideráveis na qualidade e na quantidade da produção das mesmas. Pouco ainda é conhecido sobre a população desse vírus nas principais regiões produtoras de cucurbitáceas do país, bem como o efeito da presença dele em sementes oriundas de plantas infectadas. Sendo assim, este trabalho foi realizado com o objetivo de, além de sequenciar e analisar a diversidade genética de isolados de SqMV coletados nos estados de Tocantins e São Paulo, verificar a possibilidade de utilização de análise de imagens para a avaliação dos danos internos e a utilização das técnicas DAS-ELISA e IC-PCR para detecção do SqMV em sementes produzidas por plantas de abobrinha de moita infectadas. Para o estudo da diversidade genética foram utilizados primers desenhados com base nas sequências de SqMV disponíveis no banco de dados, para amplificar um fragmento genômico com 2.599 nucleotídeos (nt) de cada isolado contendo parte do gene da proteína de movimento (MP), as duas subunidades da proteína do capsídeo (LCP e SCP) e a região 3’ UTR. Quando as sequências dos 2.490 nt (região codificável dos genomas) foram analisadas, observou-se que houve variação de 89% a 98%, quando os isolados brasileiros foram comparados entre si e de 82% a 88%, quando comparados com isolados do GenBank. Quando os genes foram comparados separadamente, as identidades de nucleotídeos foram semelhantes, entretanto, as substituições nem sempre resultaram na mudança de aminoácidos, de modo que as identidades entre os aminoácidos foram acima de 90%, com exceção do gene MP do GR2, que variou entre 82 e 83%. Na análise da região 3’ UTR, o isolado MOC apresentou a menor identidade, entre 39% e 42%, e os demais isolados brasileiros se agruparam separadamente dos isolados do GenBank. Na maioria das árvores filogenéticas os isolados brasileiros se agruparam separadamente dos isolados empregados para comparação, tendo ocorrido maior proximidade entre os isolados LC2 e MOC, e maior distância dos isolados entre esses LC3 e FA. Nos isolados empregados para comparação, houve maior proximidade entre o isolado EU421060 da China com o isolado dos Estados Unidos AF059532, em todas as árvores, e do isolado dos Estados Unidos AF059533 com o NC 003800 do Japão; nas árvores construídas para os nucleotídeos e aminoácidos da MP, nucleotídeos da subunidade maior e menor da CP e deste com o isolado KP223324 da Espanha. Quando foram comparados os aminoácidos do fragmento total e as árvores construídas para a CP1 e CP2, notou-se maior proximidade entre os isolados dos Estados Unidos (AF059533) e o da Espanha KP223324. Neste estudo apresentam-se os primeiros relatos sobre a caracterização genômica de isolados do SqMV no Brasil. A análise de imagens para a avaliação dos danos internos em sementes possibilitou a classificação das sementes em três categorias: vazias, cheias e danificadas. No teste de germinação, sementes infectadas e classificadas como cheias produziram mais plântulas anormais quando comparadas às sadias de mesma categoria. Observou-se, ainda, redução no vigor dessas sementes infectadas pelo SqMV. A análise radiográfica revelou-se como uma ferramentas útil na avaliação da qualidade das sementes produzidas por plantas infectadas com o SqMV. Os métodos DAS-ELISA e IC-RT-PCR foram eficientes na detecção do SqMV em sementes. Teste de transmissibilidade ou outros estudos envolvendo vírus que infectam sementes de abóbora podem, então, ser otimizados com a utilização dessas técnicas.
Abstract
The Squash mosaic virus (SqMV) infects plants of Cucurbitaceae family and can cause frequent yield losses. Little is known about the virus population in the main Brazilian cucurbit-producing regions as well as the effect of this virus on seeds coming from infected plants. Thus, the objective of this study was to sequence and analyze the genetic diversity of SqMV isolates collected in Tocantins and São Paulo, check the possibility of using image analysis for the evaluation of internal damage and use of DAS-ELISA techniques and IC-PCR for the detection of SqMV seeds produced by infected squash plants. In order to study the genetic diversity were designed primers based on SqMV sequences available in the GenBank, to amplify a genomic fragment with 2599 nucleotides (nt) of each isolate containing part of the movement protein gene (MP), the two subunits of the capsid protein (LCP and SCP) and the 3 'UTR. The sequence analysis of 2490nt (genome coding region) showed an identity ranging from 89% to 98%, when the Brazilian isolates were compared, and 82% to 88% when they were compared with GenBank isolates. Comparing the genes, separately, the nucleotide identities were similar. However, substitutions not always resulted in amino acids changing so that identities between amino acids was over 90%, excluding GR2 MP gene, which showed an identity between 82% and 83%. In the analysis of the 3 'UTR, the MOC isolate showed the lowest identity, between 39 and 42%, and the remaining Brazilian isolates clustered separately from GenBank isolates. In most phylogenetic trees, Brazilian isolates clustered separately from the isolates used for comparison, and there was a closer relationship between the LC2 and MOC isolates, and greater distance between these isolates LC3 and FA. Among the GenBank isolates, there was a closer relationship between the EU421060 isolate from China and the AF059532 American isolate in all the trees. Closer relationship was also seen between the AF059533 American isolate and NC003 800 Japanese isolate in the trees based on nucleotides and amino acids sequences of the MP and CP1 nucleotides. In the trees based on the amino acid of the 2490 nt fragment, NC003800 Japanese isolate were closer to KP223324 Spanish isolate and the trees built for CP1 and CP2 noticed a greater proximity between the isolated American isolate (AF059533 ) and Spanish isolate KP223324. This study presents the first reports on the genomic characterization of SqMV isolates in Brazil. The image analysis for the evaluation of possible internal damage seed sorting of the seeds in three categories: empty, full and damaged. In the germination test, infected seeds classified as full seeds produced more abnormal seedlings compared to the healthy seeds of the same category. There was also a reduction in seed vigor of when they were infected with SqMV. Radiographic analysis has proved to be a useful tool in assessing the quality of seed produced by SqMV infected plants. DAS-ELISA and IC-RT-PCR methods were efficient in detecting SqMV seed. Tests involving virus transmissibility or even other investigations related to virus infected seeds can be greatly improved by using these techniques.
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Citação
ALENCAR, N. E. Caracterização genética de isolados do Squash mosaic virus (SqMV) e análise de imagens para avaliação da qualidade fisiológica de sementes produzidas por plantas de abóbora infectadas. 2015. 97 p. Tese (Doutorado em Agronomia/Fitopatologia)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2015.