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Validation of reference genes for RT-qPCR in cardiac tissue of rats induced to obesity and diabetes
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Resumo
A validação dos genes de referência é uma etapa essencial para qualquer análise de RT-qPCR.
Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo identificar e validar genes de referência
para RT-qPCR em tecido cardíaco de ratos da espécie Rattus norvegicus albinus, submetidos
à obesidade associada ou não ao diabetes mellitus tipo 2. Para isso, as alterações metabólicas
foram induzidas no 42º dia de vida e a eutanásia foi realizada no 70º dia. Os ápices cardíacos
foram coletados e destinam-se à extração de RNA. A técnica de RT-qPCR foi realizada em
termociclador próprio, a eficiência dos primers encontrados pelo software LinReg e a
estabilidade da expressão dos genes de referência nas amostras foram analisadas pelo
algorítmo RefFinder. Os candidatos a genes de referência foram GAPDH, POLR2A, RPL32 e
RPL4 e o gene alvo usado para verificar as diferenças na expressão gênica dos candidatos a
genes de referência foi CMA1. Os animais obesos apresentaram uma diminuição na expressão
do gene CMA1 quando comparados aos dois genes de referência mais estáveis. O oposto
ocorre quando comparado aos dois genes de referência menos estáveis. Os genes GAPDH e
POLR2A são os melhores para normalizar as reações com as amostras em questão. Não há
gene de referência universal para todas as situações, o que requer validação sistemática para cada situação. O uso de genes de referência não validados pode comprometer a interpretação
da expressão dos genes alvo, o que impediria a reflexão da situação real.
Abstract
The validation of reference genes is an essential step for any RT-qPCR analysis. In this way, the present paper aimed to identify and validate reference genes for RT-qPCR in cardiac tissue of rats of the Rattus norvegicus albinus specie, submitted to obesity associated or not to type 2 diabetes mellitus. For this, the metabolic changes were induced at the 42nd day of life and the euthanasia was performed on the 70th day. The heart apexes were collected and destinates for RNA extraction. The RT-qPCR technique was performed in own thermocycler, the efficiency of the primers found by the LinReg software and the stability of the expression of the reference genes in the samples was analyzed by the RefFinder algorithm. The candidates for reference genes were GAPDH, POLR2A, RPL32, and RPL4 and the target gene used to verify the differences in gene expression of candidates for reference genes was CMA1. The obese animals showed a decrease in CMA1 gene expression when compared to the two most stable reference genes. The opposite occurs when it is compared to the two less stable reference genes. The GAPDH and POLR2A genes are the best to normalize the reactions with the samples in question. There is no universal reference gene for all situations, which requires systematic validation for each situation. The use of unvalidated reference genes may compromise the interpretation of the expression of the target genes, which would prevent the reflection of the actual situation.
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OLIVEIRA, M. M. de et al. Validation of reference genes for RT-qPCR in cardiac tissue of rats induced to obesity and diabetes. Research, Society and Development, Vargem Grande Paulista, v. 9, n. 11, e1599119702, 2020. DOI: http://dx.doi.org/10.33448/rsd-v9i11.9702.
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